黑曲霉中幽黑素合成途徑、生產(chǎn)、純化及對UV-C輻射的防護能力
研究背景：載人太空任務(wù)面臨的一個主要挑戰(zhàn)是宇宙輻射和太陽輻射的防護。地球的磁場可以保護我們免受這些輻射的傷害，但在太空旅行中，宇航員需要額外的防護措施。黑曲霉是一種已知的高輻射抗性真菌，廣泛應(yīng)用于生物技術(shù)領(lǐng)域。它能夠?qū)⒖稍偕参锷镔|(zhì)轉(zhuǎn)化為多種產(chǎn)品，如有機酸、蛋白質(zhì)、酶和次級代謝產(chǎn)物。黑曲霉是一種已知的高輻射抗性真菌，廣泛應(yīng)用于生物技術(shù)領(lǐng)域。它能夠?qū)⒖稍偕参锷镔|(zhì)轉(zhuǎn)化為多種產(chǎn)品，如有機酸、蛋白質(zhì)、酶和次級代謝產(chǎn)物。此外，黑曲霉在模擬微重力條件下生長良好，其孢子對空間輻射（包括UV-C、宇宙輻射和X射線）具有極高的抵抗力。幽黑素是一種具有抗氧化和自由基清除特性的色素，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜且具有高度的異質(zhì)性，能夠有效吸收和分散各種形式的輻射，包括紫外線和電離輻射。本研究探索了黑曲霉生產(chǎn)幽黑素的能力，研究中使用了黑曲霉的不同菌株，并通過在培養(yǎng)基中添加L-酪氨酸來誘導(dǎo)幽黑素的過量生產(chǎn)。
通過CRISPR-Cas9技術(shù)敲除黑曲霉中的hppD和hmgA基因，以增強幽黑素的生產(chǎn)。通過酸化和冷凍干燥等步驟從培養(yǎng)液中提取幽黑素。使用紫外-可見光譜（UV-Vis）、傅里葉變換紅外光譜（FTIR）和拉曼光譜等方法對幽黑素進行表征。通過DPPH自由基清除實驗評估幽黑素的抗氧化能力，并通過UV-C輻射實驗評估其輻射防護效果。并通過誘導(dǎo)過量生產(chǎn)來提高產(chǎn)量。同時，評估幽黑素對非電離輻射（如UV-C）的防護效果，并與合成的幽黑素（PyoSyn）進行比較。此外，研究還探討了幽黑素在生物技術(shù)、生物醫(yī)學(xué)和太空探索中的潛在應(yīng)用價值。研究成功在黑曲霉中誘導(dǎo)生產(chǎn)了幽黑素（PyoFun），并通過光譜分析確認了其結(jié)構(gòu)。PyoFun表現(xiàn)出強大的抗氧化能力，其自由基清除能力約為抗壞血酸的80%。在UV-C輻射實驗中，PyoFun對UV-C輻射具有顯著的防護效果，尤其是在缺乏DHN-黑色素的菌株中，PyoFun的防護效果更為顯著。
丹麥Biosense微生物生長曲線監(jiān)測系統(tǒng)（oCelloScope?）的應(yīng)用
oCelloScope?被用于評估黑曲霉孢子在經(jīng)過UV-C輻射后的生存能力。oCelloScope在本研究中主要應(yīng)用于孢子萌發(fā)與菌絲形成的觀察。在輻射實驗后，使用oCelloScope?在22°C下對孢子進行48小時的觀察。該設(shè)備通過數(shù)字時間延遲顯微技術(shù)生成高分辨率的微生物圖像，并通過z軸掃描創(chuàng)建一系列圖像。oCelloScope?利用內(nèi)置的SESA真菌算法，通過分析z軸圖像上的像素變化，量化孢子萌發(fā)和菌絲形成的動態(tài)過程。這種方法能夠?qū)崟r監(jiān)測孢子的生長情況，為評估輻射對孢子生存能力的影響提供了直觀的數(shù)據(jù)支持。通過oCelloScope?的應(yīng)用，研究人員能夠更準確地評估黑曲霉孢子在輻射條件下的生存能力，以及幽黑素對輻射防護的實際效果。
實驗結(jié)論
通過基因工程手段，成功利用黑曲霉（Aspergillus niger）生產(chǎn)并分泌幽黑素（pyomelanin），并對其抗氧化和輻射防護能力進行了系統(tǒng)評估。黑曲霉菌株OS4.3通過敲除hmgA基因，能夠高效生產(chǎn)并分泌幽黑素（PyoFun）。該色素主要存在于細胞外，便于純化，且產(chǎn)量較高（1.5 g/L培養(yǎng)液）。通過紫外-可見光譜（UV-Vis）、傅里葉變換紅外光譜（FTIR）和拉曼光譜分析，確認了PyoFun的化學(xué)結(jié)構(gòu)與合成的幽黑素（PyoSyn）一致，均為黑色素類物質(zhì)。PyoFun表現(xiàn)出強大的抗氧化能力，其自由基清除能力約為抗壞血酸的80%。純化的PyoFun比未經(jīng)純化的培養(yǎng)上清液具有更高的自由基清除活性，表明純化過程對提高抗氧化能力至關(guān)重要。PyoFun對UV-C輻射具有顯著的防護效果，尤其是在缺乏DHN-黑色素的菌株（MA93.1）中，其防護效果更為顯著。在1,038 J/m2的UV-C輻射劑量下，PyoFun顯著提高了孢子的生存率，而合成的PyoSyn則未表現(xiàn)出顯著的防護效果。
圖1、研究的實驗工作流程圖。展示了研究的整體流程，包括黑曲霉菌株的培養(yǎng)、幽黑素（PyoFun）的生產(chǎn)、純化、光譜分析、抗氧化測試以及輻射屏蔽測試等步驟。
圖2、A）幽黑素生物合成途徑；（B）黑曲霉菌株的生長表型。圖(A)展示了黑曲霉中幽黑素形成的生物合成途徑，包括關(guān)鍵基因和代謝產(chǎn)物。圖(B)展示了在含有L-酪氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，野生型和基因敲除突變株（hppD和hmgA）的生長表型差異。
圖3、黑曲霉中幽黑素的生產(chǎn)和純化。展示了黑曲霉菌株OS4.3在含有L-酪氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，通過酸化和冷凍干燥步驟純化出的幽黑素（PyoFun）的過程。
圖4、幽黑素的物理化學(xué)特性。展示了PyoFun在不同溶劑中的溶解性測試結(jié)果，以及在過氧化氫處理后的褪色情況，表明PyoFun具有抗氧化活性。
圖5、幽黑素對UV-C輻射的防護能力。應(yīng)用ocelloScope展示了黑曲霉野生型（N402）和DHN-黑色素缺陷型（MA93.1）孢子在經(jīng)過PyoFun和PyoSyn保護后，對UV-C輻射的耐受性的生長過程。結(jié)果顯示，PyoFun顯著提高了孢子的生存率，尤其是在DHN-黑色素缺陷型菌株中。
總結(jié)
黑曲霉（Aspergillus niger）作為一種細胞工廠用于生產(chǎn)具有紫外線（UV-C）輻射屏蔽活性的幽黑素（pyomelanin）。黑曲霉（Aspergillus niger）是一種已知的高輻射抗性真菌，廣泛應(yīng)用于生物技術(shù)領(lǐng)域，是生產(chǎn)黑色素的候選菌株。本研究通過在重組的ΔhmgA突變株（OS4.3）中誘導(dǎo)過量生產(chǎn)色素，研究了黑曲霉中真菌幽黑素（PyoFun）的生產(chǎn)。通過三種光譜方法對PyoFun色素進行了表征，并通過DPPH自由基清除實驗評估了其抗氧化特性。此外研究人員還評估了PyoFun對非電離輻射（單色UV-C）的保護效果，并將其與合成的對照幽黑素（PyoSyn）進行了比較。oCelloScope?在本研究中被用于評估黑曲霉孢子在經(jīng)過UV-C輻射后的生存能力，使用oCelloScope?在22°C下對孢子進行48小時的觀察，通過實時監(jiān)測孢子的生長情況，為評估輻射對孢子生存能力的影響提供了直觀的數(shù)據(jù)支持。結(jié)果證實了通過誘導(dǎo)過量生產(chǎn)在黑曲霉中成功生產(chǎn)了PyoFun。光譜方法的表征確認了PyoFun的存在，DPPH實驗顯示了其強大的抗氧化特性。此外PyoFun在抵御輻射誘導(dǎo)的應(yīng)激方面表現(xiàn)出高度的保護效果，超過了PyoSyn的保護效果。本研究結(jié)果表明，PyoFun作為一種生物屏蔽劑對抗有害輻射具有顯著潛力。值得注意的是，PyoFun是胞外合成的，這使其與其他真菌黑色素（如L-DOPA或DHN黑色素）不同，后者需要細胞裂解才能純化色素。這一特性使PyoFun成為生物技術(shù)、生物醫(yī)學(xué)和太空工業(yè)的寶貴資源。然而仍需進一步研究以評估其在干燥形式下以及對電離輻射的保護效果。未來的研究需要進一步探索PyoFun在干燥形式下的防護效果，以及其對電離輻射的防護能力。這項研究不僅展示了黑曲霉在生產(chǎn)具有輻射防護能力的幽黑素方面的潛力，還為未來的太空探索和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用提供了新的思路。