基于超微藥粉瓊脂稀釋法檢測9種致病菌對常用15種中藥的敏感性（一）
細菌性傳染病是水產養殖動物的主要疾病之一，對水產養殖的危害最嚴重，常導致養殖魚類的大量死亡，造成巨額經濟損失。致病菌對抗菌藥物的耐藥性程度和頻率越來越高，篩選高效的抗菌藥物仍然是治療細菌性傳染病的最主要方法。在測試致病性細菌對某一藥物的敏感性時，常用的方法有濾紙片法、牛津杯法、試管二倍稀釋法、平板二倍稀釋法。目前，這四種檢測方法存在操作繁瑣、工作量大、周期長、培養條件不一致等問題，不能快速地確定致病菌株對各藥物的敏感性。尤其在初步篩選抗菌中藥時，植物藥材種類繁多，每種藥材預先要粗提其有效部位，并去除萃取溶劑，操作程序更復雜、耗時更長。
本研究目的是為了建立針對多株致病菌可同步進行初篩抗菌中藥的一種快速簡便的藥敏實驗方法。首先利用超微粉碎機將15種植物藥材粉碎成微米級顆粒（5～10μm），可提高藥材中抑菌成分的有效溶出；隨后將超微藥粉添加到M-H營養瓊脂培養基內制成系列藥物濃度的固體平板，再接種9株致病菌于同一瓊脂平板上進行藥敏實驗，24 h培養后觀察供試菌的菌落生長情況，以無菌落形成的最低濃度為該中藥的最低抑菌濃度（MIC），該方法定名為超微藥粉瓊脂稀釋法。
1材料和方法
1.1藥材與試劑
五倍子（Galla Chinensis，縮寫GC，產地湖北）；石榴皮（Pomegranate Rind，縮寫PR，產地安徽）；大黃（RhubarbOfficinale，縮寫RO，產地甘肅）；黃芩（Baical Skullcap Root，縮寫BSR，產地河北）；虎杖（Rhizoma Polygoni Cuspidati，縮寫RPC，產地福建）；黃連（Golden Thread，縮寫GT，產地四川）；連翹（Weeping Forsythia Capsule，縮寫WFC，產地江西）；知母（Common Anemarrhena Rhizome，縮寫CAR，產地河北）；首烏藤（Caulis Polygoni Multiflori，縮寫CPM，產地江蘇）；地榆（Radix Sanguisorbae，縮寫RS，產地福建）；貫眾（Dryopteris Setosa，縮寫DS，產地四川）；金銀花（Flos Lonicerae，縮寫FL，產地遼寧）；紫花地?。≒urpleflower Violet，縮寫PV，產地河南）；馬齒莧（Portulaca Oleracea Linn，縮寫POL，產地福建）；苦楝皮（Cortex Meliae，縮寫CM，產地四川），均購自國藥控股福建有限公司；標準肉湯培養基（Mueller-Hinton Broth，M-H），購自廣東環凱微生物科技有限公司。
1.2菌株
9株魚類致病菌均為本研究室從漳浦、莆田、龍巖、福清等養殖場病鰻中分離得到，并經人工感染實驗證實為致病菌，同時菌株進行生理生化和基因鑒定，分別確定為氣單胞菌屬（Aeromonas sp.）B01、B19、豚鼠氣單胞菌（Aeromonas caviae）B14、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）B10、B15、B18、B20、B27、腸棕氣單胞菌（Aeromonas enteropelgenes）B09。
1.3菌懸液制備
從保種斜面上挑取菌苔劃線接種M-H瓊脂（Mueller-Hinton Agar）平板，置于28℃恒溫培養箱內培養20 h；挑取單個菌落劃線至新鮮斜面上，28℃培養24 h后，用無菌生理鹽水將菌體沖洗下來，采用酶標儀測定菌液濃度，測定波長為600 nm。采用菌落計數法確定細菌密度與吸光度OD600的關系數，不同菌株的菌液OD600值約為0.2～0.3時，對應活菌計數值約為108CFU/ml，將菌液濃度稀釋10倍調至107CFU/ml，即可作為藥敏實驗接種的菌懸液。
1.4中藥高壓水提液的制備
稱取50 g的中藥超微粉，加蒸餾水300 ml置于20 kHz超聲處理40 min后，置于高壓滅菌鍋中煎煮（110℃、10 min，95℃、30 min）提取，然后用50 ml離心管分裝，用冷凍離心機8 000 r/min離心10 min，取上清液，放置4℃冰箱保存備用。
1.5超微藥粉或藥液瓊脂稀釋藥物敏感實驗
在M-H培養基添加超微粉碎的中藥粉末或者高壓水提的藥液，以濃度6 g/ml和1 g/ml開始進行二倍稀釋，配置不同濃度梯度的藥敏培養基。取9種已稀釋好的107CFU/ml菌液各2μl點種在經過121℃、20 min滅菌后的同一個藥敏培養基平板上，每個藥物濃度梯度做3組平行。將接種好的平板放置28℃培養，24 h后觀察供試菌的菌落生長情況，以無菌落形成的最低濃度為中藥的最低抑菌濃度（MIC）。
1.6紙片法的藥物敏感實驗
首先用無菌蒸餾水將高壓水提的藥液進行二倍稀釋，配置不同濃度梯度的實驗藥液；用打孔器將濾紙打成直徑為6 mm的圓紙片，經121℃高壓滅菌30 min，將此無菌濾紙片分別浸入藥液中，充分浸泡6 h后，用無菌鑷子移至無菌試管中，再滴加50μl藥液放在37℃干燥箱中烘干制成飽和的藥敏紙片；取已配制成107CFU/ml的菌懸液100μl均勻涂布于90 mm瓊脂平板上，將飽和的藥敏紙片貼于瓊脂平板表面，每皿貼5片不同濃度藥敏紙片，于28℃恒溫培養箱中培養24 h后，測量其抑菌圈直徑。每個濃度的藥物平行重復測試3次，判斷致病菌對藥物的敏感度。
2結果
2.1超微藥粉瓊脂稀釋法測定中藥對致病菌的抑制作用
選常用15種中藥，采用本研究建立的超微藥粉瓊脂稀釋法，檢測9株不同種屬的致病菌對它們的敏感度，從中篩選出抗菌活性高的藥材，為今后進一步研制抗菌漁藥提供參考（見表1）。從表1的實驗結果可見，五倍子的抑菌效果最佳，其次是首烏藤、地榆，再次為石榴皮、貫眾、大黃、黃芩、虎杖，其余中藥的抑菌效果極差。B01、B27對五倍子極度敏感，其余7株菌為高度敏感；除B19、B20對首烏藤顯示中度敏感外，其余7株菌均表現為高度敏感；B10對地榆顯示低度敏感，B01、B14、B27為中度敏感，B09、B15、B18、B19、B20均為高度敏感；B15、B18、B19、B20、B27對石榴皮顯示中度敏感，僅B01、B09表現高度敏感，B10顯示低度敏感，而B14顯現不敏感；B20對貫眾不敏感，B09、B27顯示低度敏感，B10、B14、B15、B19顯示對貫眾中度敏感，B01、B18對貫眾顯示高度敏感；除B01、B10、B15對大黃中度敏感外，其余均為低度敏感；9株致病菌對黃芩均呈現低度敏感。9株致病菌對虎杖的敏感性差異很大，B01、B10、B14、B18表現為高度敏感，但除B01對苦楝皮和黃連均中度敏感外，其余菌株均不敏感。
表1超微藥粉瓊脂稀釋法測定各種中藥的最低抑菌濃度（mg/l）