雞印第安納株沙門菌生長、致病性及藥物敏感性研究（四）
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雞的副傷寒是由除雞白痢、雞傷寒沙門菌之外的多種血清型沙門菌感染引起的雞常見細菌病，病原包括腸炎、鼠傷寒、印第安納等血清型沙門菌。副傷寒沙門菌中的絕大部分血清型也可導致人的感染，是對公共衛(wèi)生安全具有重要意義的人畜共患病原菌。印第安納沙門菌近年來在家禽養(yǎng)殖、屠宰加工和銷售等動物性食品生產(chǎn)環(huán)節(jié)均有流行的報道。本研究從安徽一發(fā)病雞病變組織中分離出1株疑似沙門菌，進一步通過選擇性培養(yǎng)、16S rRNA測序和全基因組序列SeqSero 1.2數(shù)據(jù)庫比對，確定為印第安納沙門菌。Shen等在安徽雞群中分離到多個血清型沙門菌，其中印第安納沙門菌是雞群中較為常見的流行血清型，并且該血清型沙門菌的污染可能隨著家禽屠宰加工進一步向產(chǎn)業(yè)鏈延伸，已經(jīng)成為我國畜禽產(chǎn)品生產(chǎn)中最常見血清型之一，威脅食品和公共衛(wèi)生安全。
菌株致病性試驗是評價其毒力的重要指標。Wang等對江蘇分離的印第安納、鼠傷寒和腸炎沙門菌進行了體內(nèi)致病性試驗，發(fā)現(xiàn)各個血清型沙門菌都可引起接毒小鼠的肝臟和腸道出現(xiàn)不同程度的臨床癥狀和組織病變，其中印第安納沙門菌的癥狀較輕，其LD50約為105 CFU/mL，致病性低于鼠傷寒和腸炎沙門菌。本研究采用SPF雛雞攻毒試驗評估分離株對雞的致病性及其LD50發(fā)現(xiàn)，SM24分離株的LD50為8.50×105 CFU，接種雛雞出現(xiàn)肝臟出血、膽囊充盈，脾臟略腫大、卵黃嚴重吸收不良等組織病變。研究發(fā)現(xiàn)，菌株毒力基因的攜帶與其致病性密切相關(guān)。通過全基因組測序和VFDB數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn)，SM24攜帶280個毒力基因，其中主要為分泌系統(tǒng)、黏附、鐵攝取、免疫逃避等相關(guān)毒力基因。
沙門菌T3SS是由SPI1和SPI2編碼的蛋白質(zhì)分泌系統(tǒng)，具有將效應蛋白直接注入宿主細胞的能力，可使細菌能夠調(diào)節(jié)宿主細胞的多種反應，如細胞骨架重排、信號轉(zhuǎn)導和細胞因子的產(chǎn)生，進而增加這些細菌的致病性。在SM24基因組中涉及分泌系統(tǒng)的基因主要編碼T3SS，分別由35個SPI1基因和39個SPI2基因編碼。除此之外，分離株基因組中還包含編碼T6SS的基因，T6SS的存在能介導細菌與細菌之間以及細菌和宿主細胞之間的相互作用，使細菌在競爭中獲得生存優(yōu)勢。
黏附因子是沙門菌重要的毒力因子，SM24菌株基因組擁有大量的菌毛黏附和運動侵襲黏附相關(guān)毒力基因。有研究發(fā)現(xiàn)，在體外黏附試驗中，印第安納沙門菌對細胞的黏附性和侵襲性明顯低于鼠傷寒和腸炎沙門菌，但在黏附后的增殖效率顯著高于其他血清型。鐵攝取能力和免疫逃逸基因是細菌在宿主體內(nèi)定殖、生長和逃避免疫的重要致病基礎(chǔ)。
分離株可以編碼多條與鐵攝取和免疫逃逸相關(guān)的基因，此外，SM24基因組中還攜帶多種與入侵、調(diào)控、營養(yǎng)等相關(guān)的毒力基因。本研究表明，分離株SM24對SPF雛雞具有明顯致病性，并引發(fā)多種組織器官的病理變化，但關(guān)于其毒力基因與禽類宿主的致病性及其致病機制仍有待進一步研究。
耐藥性表型檢測發(fā)現(xiàn)，分離株SM24為多重耐藥株，在測試的23種抗生素中對16種抗生素表現(xiàn)出耐藥性，耐藥譜廣，臨床上可選擇用于治療的藥物很少，如不通過藥敏試驗篩選，極易造成治療的失敗。劉海霞等對廣東省禽產(chǎn)品中印第安納沙門菌的耐藥情況調(diào)查發(fā)現(xiàn)，對四環(huán)素的耐藥性達100%，對環(huán)丙沙星和頭孢噻肟的耐藥性分別為55.6%和30.6%，97.2%的菌株表現(xiàn)出多重耐藥性。王魯彥等對人源及動物源印第安納沙門菌的耐藥性研究發(fā)現(xiàn)，其對多種藥物都呈現(xiàn)耐藥性，且對阿米卡星、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢吡肟、左氧氟沙星、吉米沙星的耐藥率均逐年上升。Gong等發(fā)現(xiàn)印第安納沙門菌分離株具有較高的耐藥性，尤其是對四環(huán)素類、喹諾酮類、葉酸途徑抑制劑、酚類、青霉素類、單內(nèi)酰胺類和硝基呋喃類藥物。菌株耐藥基因的攜帶率與菌株的耐藥表型呈現(xiàn)出顯著的相關(guān)性。
通過對SM24基因組序列比對，發(fā)現(xiàn)該分離株共攜帶144個與耐藥相關(guān)的編碼基因，其中大部分與多重耐藥性相關(guān)。與本研究的發(fā)現(xiàn)類似，很多研究報道顯示印第安納沙門菌基因組中攜帶大量耐藥基因。Yu等在家禽分離的印第安納沙門菌中鑒定出65個屬于不同家族的抗性基因，包括編碼與抗生素外排泵、降低β-內(nèi)酰胺滲透性、對克林霉素產(chǎn)生抗性的突變體、耐磺胺類和耐三甲氧芐啶等相關(guān)耐藥基因。
王學鋒發(fā)現(xiàn)多數(shù)印第安納沙門菌分離株攜帶blaCTX-M(blaOXA-1、blaTEM-1)、sul1、aacC4、aac(6′)-Ib、floR和dfrA17耐藥基因。一些研究發(fā)現(xiàn)，在從雞或雞肉產(chǎn)品中分離的印第安納沙門菌的基因組中出現(xiàn)mcr-1基因，在本研究和已報道的安徽地區(qū)雞源印第安納沙門菌基因組中尚未發(fā)現(xiàn)mcr-1基因的攜帶。由于mcr-1基因編碼的耐黏菌素基因可導致“超級細菌”的出現(xiàn)，因此應持續(xù)關(guān)注mcr-1基因在沙門菌中的分子流行動態(tài)。
研究表明，印第安納沙門菌的多重耐藥性與細菌染色體上的1類整合子和IncHI2質(zhì)粒攜帶的多種抗生素耐藥基因密切相關(guān)。本研究中SM24分離株基因組中未發(fā)現(xiàn)1類整合子基因，但在其基因組中存在1個IME位點并攜帶OmpK37耐藥基因。SM24基因組中攜帶的質(zhì)粒類型為IncHI2質(zhì)粒，包含IncHI2和IncHI2A兩個復制子，并且攜帶11種不同的耐藥基因，由此推斷，該印第安納沙門菌分離株具有整合和水平轉(zhuǎn)移耐藥基因的能力。細菌為應對外界環(huán)境的變化，在遺傳進化過程中會形成獨有的基因組特征。
分離株與6株國內(nèi)雞源印第安納沙門菌分離株基因組的比較分析表明，除共有基因外，分離株SM24擁有最多的獨有基因。通過構(gòu)建的細菌基因組進化樹發(fā)現(xiàn)，分離株SM24與國內(nèi)6株印第安納沙門菌的遺傳距離均較遠，表明其可能具有較為獨特的生理和代謝特征，可為進一步研究相關(guān)獨有基因功能提供基礎(chǔ)素材。
4結(jié)論
從安徽肥東地區(qū)發(fā)病雞病變組織中分離出1株印第安納沙門菌，該分離株對雛雞具有致病性，對16種抗生素表現(xiàn)出明顯耐藥性，耐藥譜廣。進一步全基因測序分析，發(fā)現(xiàn)其基因組攜帶大量毒力和耐藥相關(guān)基因，且具有可轉(zhuǎn)移耐藥基因的IME位點和IncHI2質(zhì)粒。本研究為深入探討印第安納沙門菌致病和耐藥的分子機制提供參考。
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