膿腫分枝桿菌胞內(nèi)菌落計(jì)數(shù)、對(duì)RAW264.7細(xì)胞血紅素氧化酶1調(diào)控自噬影響（二）
1.1.2主要試劑和儀器
高糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于普賽諾公司；Cobaltic ProtoporphyrinⅨChloride（CoPP）（Cat#sc-294098）、Tin ProtoporphyrinⅨdichloride（SnPP）（Cat#sc-203452）購(gòu)于美國(guó)Santa cruz公司；抗LC3Ⅰ/Ⅱ抗體（Cat#12741S）、抗ATG5抗體（Cat#12994）、抗GADPH抗體（Cat#5174）、第二抗體抗兔IgG抗體（Cat#7074S）購(gòu)于美國(guó)CST公司；HO-1（Cat#10701-1-AP）購(gòu)于Proteintech公司；SQSTM1/p62（Cat#AG4400）、特級(jí)胎牛血清（Cat#13011-8611）購(gòu)于碧云天生物技術(shù)公司；CCK8（Cat#K1018）、3-MA（Cat#A8353）購(gòu)于APEXBIO公司；LysoTracker Red DND-99（Cat#MX4317-50UL）購(gòu)于懋康生物技術(shù)有限公司；DAPI購(gòu)于Bioss公司；TNF-α（Cat#87E2072700）為云克隆產(chǎn)品；6孔板購(gòu)于NEST公司；阿米卡星注射液購(gòu)于宜昌人福藥業(yè)有限公司。顯影膠片（Cat#YA0360）為柯達(dá)公司產(chǎn)品；蛋白電泳槽為Bio-Rad公司產(chǎn)品；轉(zhuǎn)膜儀為北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；免疫熒光顯微鏡為Nikon DS-Qi2型號(hào)。
1.2方法
1.2.1 M.abs培養(yǎng)及準(zhǔn)備
將M.abs標(biāo)準(zhǔn)株ATCC19977接種于7H9液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)3~5 d，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)菌，調(diào)整細(xì)菌濃度1.5×108 CFU/ml，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
1.2.2 RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)及M.abs刺激
RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到80%貼壁時(shí)，無(wú)菌PBS清洗3次，含0.2%EDTA胰酶消化2 min，調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×105個(gè)/ml，取2 ml鋪于6孔板，待細(xì)胞完全貼壁后，加入30μmol/L CoPP或30μmol/L SnPP預(yù)處理12 h，在RAW264.7巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)分別以感染復(fù)數(shù)（MOI）（M.abs∶RAW264.7）為5∶1、10∶1和15∶1比例加入M.abs刺激2 h（活菌濃度分別為：2.5×106 CFU/ml、5×106 CFU/ml、7.5×106 CFU/ml），無(wú)菌PBS漂洗3次，加入含34μg/ml阿米卡星完全培養(yǎng)基作用2 h去除胞外菌，無(wú)菌PBS漂洗3次，繼續(xù)培養(yǎng)至指定時(shí)間，收集不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞蛋白保存于-20℃待測(cè)（蛋白提取見(jiàn)1.2.4）。
1.2.3 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性
CCK-8檢測(cè)參照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，簡(jiǎn)要操作如下：調(diào)整RAW264.7細(xì)胞密度2.5×105個(gè)/ml，吸取100μl鋪于96孔板，待細(xì)胞完全貼壁后，加入終濃度為30μmol/L CoPP和30μmol/L SnPP處理48 h或直接加入M.abs共孵育48 h，處理完畢后，分別加入CCK-8檢測(cè)溶液10μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，檢測(cè)A450。細(xì)胞活力（%）=（實(shí)驗(yàn)組吸光度-空白組吸光度）/（對(duì)照組吸光度-空白組吸光度）×100%。所有實(shí)驗(yàn)濃度均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次，取平均值計(jì)算。
1.2.4 Western blot
細(xì)胞按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案處理結(jié)束后，每孔加入含蛋白酶和磷酸酶抑制劑coctail的RIPA緩沖液200μl，收集細(xì)胞并置冰上裂解30 min，將蛋白裂解液于4℃、12 000 r/min離心15 min，收集上清用BCA蛋白測(cè)定試劑盒檢測(cè)待檢樣本濃度，置于-20℃冰箱保存。取20μg蛋白與5×蛋白上樣緩沖液混合，置于100℃金屬浴5 min，取等量制備好的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳完畢后，將蛋白通過(guò)轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移到0.45μm PVDF膜上，PBST稍微漂洗后用5%脫脂牛奶封閉1 h，孵育一抗4℃過(guò)夜（抗HO-1抗體、抗ATG5抗體、抗LC3Ⅰ/Ⅱ抗體、抗p62抗體和抗GAPDH抗體），PBST漂洗3次，每次5 min。孵育相應(yīng)的二抗，室溫放置1 h，再次用PBST漂洗3次，每次5 min。ECL顯影液進(jìn)行顯影。采用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。
1.2.5 LysoTracker Red染色
調(diào)整細(xì)胞濃度2.5×105個(gè)/ml，并取1 ml接種到含細(xì)胞爬片的12孔板中，待細(xì)胞完全貼壁后，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)CoPP和SnPP預(yù)處理細(xì)胞12 h，加入M.abs（MOI=5）共孵育2 h，無(wú)菌PBS洗3次，重新加入含LysoTracker Red（200 nmol/L）完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)1 h，無(wú)菌PBS洗3次后，加入DAPI染液進(jìn)行細(xì)胞核染色10 min，免疫熒光顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞觀察并拍照保存，采用Image J軟件對(duì)各組進(jìn)行量化分析。
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