不同條件下裂片石莼水培液的組成成分對(duì)耐藥弧菌株的抑菌作用（三）
2、結(jié)果與討論
2.1分離弧菌的生化鑒定與耐藥性表征
16S rDNA測(cè)序結(jié)果顯示，6株與弧菌屬同源性超過(guò)99%的菌株，分別為1株副溶血性弧菌(Vp.W1)、1株梅氏弧菌(Vm.R3)、1株錫那羅州弧菌(Vs.W2)和3株溶藻弧菌(Va.W1、Va.S1、Va.M3)(表2)。6株弧菌均為有動(dòng)力的革蘭氏陰性菌，且在無(wú)鹽環(huán)境中不能生長(zhǎng)。其中，溶藻弧菌和Vs.W2在高濃度NaCl(10%)環(huán)境中可以旺盛生長(zhǎng)，而Vp.W1和Vm.R3只能在3%~8%的NaCl環(huán)境中生長(zhǎng)。Vs.W2和Vm.R3的氧化酶為陰性反應(yīng)，菌落外圍有透明環(huán)，具有β-溶血性，溶血性是決定弧菌毒力的重要特征，因此其致病性較強(qiáng);而其余4株弧菌均無(wú)透明溶血環(huán)，無(wú)致病性，這可能與它們是否存在溶血素基因相關(guān)。
表2分離弧菌生化特征及16S rDNA
+表示為陽(yáng)性反應(yīng)，–表示為陰性反應(yīng)，Vp.W1:來(lái)源于白蝦養(yǎng)殖水的副溶血性弧菌，Vs.W2:來(lái)源于對(duì)蝦養(yǎng)殖水的錫那羅州弧菌，Vm.R3:來(lái)源于蛤仔的梅氏弧菌，Va.W1:來(lái)源于白蝦養(yǎng)殖水的溶藻弧菌，Va.S1:來(lái)源于白蝦的溶藻弧菌，Va.M3:來(lái)源于蛤仔養(yǎng)殖沉積物的溶藻弧菌
分離弧菌對(duì)不同抗生素的耐藥水平和藥敏性見(jiàn)圖1。抗生素阿莫西林和氨芐青霉素對(duì)6株弧菌的抑菌圈直徑均小于13 mm，表明弧菌均對(duì)阿莫西林和氨芐青霉素耐藥。抗生素哌拉西林對(duì)3株溶藻弧菌和Vp.W1的抑菌圈直徑小于17 mm，對(duì)Vs.W2的抑菌圈直徑小于21 mm，耐藥率和中介率分別為66.7%和16.7%。另外，抗生素頭孢唑林和卡那霉素分別對(duì)Va.S1和Va.M3的直徑小于18 mm，中介率均為16.7%。抗生素鏈霉素對(duì)Va.S1和Va.M3的直徑小于15 mm，抗生素環(huán)丙沙星對(duì)Va.S1和Va.W1的直徑小于21 mm，兩種抗生素的中介率均為33.3%。然而，所有弧菌均對(duì)其余抗生素頭孢他啶、頭孢西丁、頭孢噻肟、美羅培南、亞胺培南、阿米卡星、慶大霉素、左氧氟沙星、氯霉素、四環(huán)素、復(fù)方新諾明敏感。因此，3株溶藻弧菌和Vp.W1具有阿莫西林、氨芐青霉素和哌拉西林三重耐藥性，Vs.W2和Vm.R3則有阿莫西林和氨芐青霉素雙重耐藥性，均為β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素。有研究報(bào)道，從貝類(lèi)和海水樣品中分離的弧菌有14.3%至50.0%對(duì)至少3種抗生素表現(xiàn)出多重抗生素耐藥性，并且對(duì)氨芐青霉素和頭孢唑林的耐藥率均達(dá)50%以上，對(duì)卡那霉素、甲氧嘧啶和鏈霉素等也具有中等耐藥水平。可見(jiàn)，對(duì)多種抗生素耐藥的病原菌在海水養(yǎng)殖環(huán)境中普遍存在。
圖1弧菌對(duì)抗生素的抑菌圈直徑(a-d)及耐藥率(e)
注:Vp.W1:來(lái)源于白蝦養(yǎng)殖水的副溶血性弧菌，Vs.W2:來(lái)源于對(duì)蝦養(yǎng)殖水的錫那羅州弧菌，Vm.R3:來(lái)源于蛤仔的梅氏弧菌，Va.W1:來(lái)源于白蝦養(yǎng)殖水的溶藻弧菌，Va.S1:來(lái)源于白蝦的溶藻弧菌，Va.M3:來(lái)源于蛤仔養(yǎng)殖沉積物的溶藻弧菌
2.2裂片石莼水培液對(duì)弧菌生長(zhǎng)的抑制特性
由弧菌24 h生長(zhǎng)曲線可知(圖2)，弧菌在高濃度(1.0×105 CFU/mL)條件下比相比于低濃度(1.0×103 CFU/mL)提前1~3 h到達(dá)峰值，生長(zhǎng)更快。初始4 h內(nèi)，各弧菌處于生長(zhǎng)遲緩期，生長(zhǎng)量無(wú)明顯增長(zhǎng);4~12 h為弧菌對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，各弧菌生長(zhǎng)量快速增長(zhǎng);12~24 h則進(jìn)入穩(wěn)定期，生長(zhǎng)量(OD600nm)在小范圍內(nèi)上下浮動(dòng)，增加或下降0~0.4。
圖2弧菌24 h生長(zhǎng)曲線
由上述生長(zhǎng)曲線可知，各弧菌生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期至少需要8 h，且對(duì)照組在16~24 h處于增長(zhǎng)狀態(tài)，因此在12 h計(jì)算各弧菌抑制率如圖3。裂片石莼水培液對(duì)各弧菌具有不同的抑制作用，Vp.W1、Vs.W2和Vm.R3在1.25~10 g/L的裂片石莼水培液培養(yǎng)1 d時(shí)的抑制率范圍為1.32%~39.42%，但在培養(yǎng)3 d時(shí)抑制率處于64%~100%，且10 g/L處理組抑制率達(dá)80%以上，顯著高于第1 d(10.37%~30.06%)(P<0.05)。其中，培養(yǎng)1 d時(shí)低密度(2.5 g/L)的水培液對(duì)Vs.W2沒(méi)有抑制作用，對(duì)溶藻弧菌抑制率均不超過(guò)35%，且培養(yǎng)1 d和3 d的抑制效果差異不顯著。
圖3不同密度的裂片石莼水培液對(duì)弧菌的抑制率
研究表明，大型海藻對(duì)弧菌的抑制作用表現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。隨著江蘺提取物濃度的增加，副溶血性弧菌(V.parahaemolyticus)和哈維氏弧菌(V.harveyi)的抑制率增加。通過(guò)先前對(duì)副溶血性弧菌的可培養(yǎng)性研究也發(fā)現(xiàn)，裂片石莼在高密度(12 g/L)條件下的抑制作用明顯高于低密度(3 g/L)。而在本實(shí)驗(yàn)中，高密度(10 g/L)的裂片石莼水培液對(duì)各弧菌的抑制率在10.46%~100%，低密度(1.25~5 g/L)在1.32%~99.3%，不具有顯著的濃度依賴性，這可能和水培液與弧菌共培養(yǎng)的時(shí)間有關(guān)。事實(shí)證明，大型海藻對(duì)不同弧菌的抑制作具有時(shí)間相關(guān)性。等鞭金藻與溶藻弧菌共培養(yǎng)后第2 d開(kāi)始溶藻弧菌數(shù)量迅速下降，第4 d幾乎檢測(cè)不到弧菌。裂片石莼分泌物對(duì)溶藻弧菌的抑制作用與水培液的培養(yǎng)時(shí)間緊密相關(guān)，培養(yǎng)3 d時(shí)的抑制率顯著高于培養(yǎng)1 d，這可能與活性物質(zhì)持續(xù)釋放過(guò)程相關(guān)。由于大型海藻中含有多種活性物質(zhì)，因此對(duì)細(xì)菌有明顯的抑制作用。例如裂片石莼二氯甲烷提取物中的萜類(lèi)化合物作為有效抗菌成分顯示出對(duì)副溶血性弧菌和溶藻弧菌明顯的抑制作用。裂片石莼甲醇提取物中含有脂肪酸等多種具有抗菌活性的化合物，對(duì)革蘭氏陰性菌具有較大的抑菌圈。雖然裂片石莼水培液中的活性物質(zhì)濃度低于提取物中的活性物質(zhì)濃度，但仍顯示出一定的抗菌性能。
2.3裂片石莼水培液成分分析
采用GC-MS從不同密度和培養(yǎng)時(shí)間下的9組樣品中共檢測(cè)到126種化合物，與對(duì)照組相比具有顯著差異的化合物有84種(P<0.05)，包括酸(24)、醇酚類(lèi)(10)、醛酮類(lèi)(10)、烷烴和芳香烴(8)、雜環(huán)(8)、酯(7)、胺(5)、醚(3)、氨基酸(2)、腈(2)、糖苷(2)、糖(2)及糖胺(1)等。與數(shù)據(jù)庫(kù)匹配得分在70以上的顯著差異物質(zhì)有25種，主要為醇酚類(lèi)(24%)和酸類(lèi)(24%)，且峰面積差異倍數(shù)大于50(X=∑(實(shí)驗(yàn)組峰面積/對(duì)照組峰面積)，X>50)的顯著差異物質(zhì)有10種(圖4)，包括p-HPEA、二十碳五烯酸、TBP、MEHP、半乳糖胺、2-乙基己酸、Acetal、甲基-β-D-半乳糖苷、肌醇半乳糖苷和正-辛醇，其中醇酚類(lèi)占比最大(30%)，其次是酸類(lèi)(20%)和糖苷類(lèi)(20%)。峰面積平均差異倍數(shù)在40以上的顯著差異物質(zhì)有4種，分別為2，4，6-三溴苯酚、2-(4-羥基苯)乙醇、乙縮醛和鄰苯二甲酸單(2-乙基己基)酯。
圖4 10 g/L裂片石莼3 d水培液的總離子色譜圖
裂片石莼水培液的GC-MS分析顯示MEHP、Acetal、p-HPEA和TBP為最顯著的差異活性物質(zhì)。TBP是一種單體溴酚，是溴酚中生產(chǎn)最廣泛的物質(zhì)，據(jù)報(bào)道對(duì)致病菌具有抗菌活性。來(lái)自雙孢蘑菇的乙酸乙酯提取物中濃度最高的MEHP具有抗菌和抗氧化活性。p-HPEA是一種酚醇類(lèi)化合物，Acetal是由一分子醛和兩分子醇縮合的產(chǎn)物，其含有的醛基可有效增強(qiáng)抗菌活性，大型藻類(lèi)提取物中含有包括醇類(lèi)化合物在內(nèi)的多種生物活性物質(zhì)具有抗菌潛力。除此之外，二十碳五烯酸和2-乙基己酸是脂肪酸類(lèi)化合物，在植物和藻類(lèi)中天然存在，以防御病原體，包括多重耐藥細(xì)菌銅綠假單胞菌。糖類(lèi)化合物包括甲基-β-D-半乳糖苷、肌醇半乳糖苷和半乳糖胺，是由糖基形成的含糖衍生物，可治療多種細(xì)菌感染。正-辛醇是一種飽和脂肪醇，具有較強(qiáng)的親脂性，作為抗菌劑滲透細(xì)胞壁和細(xì)胞膜以發(fā)揮作用。
進(jìn)一步以篩選種類(lèi)最多的溶藻弧菌為研究目標(biāo)，裂片石莼水培液4種優(yōu)勢(shì)成分對(duì)弧菌的MIC如表3所示。結(jié)果表明，TBP對(duì)溶藻弧菌的抑菌能力最強(qiáng)，64~128μg/mL即可完全抑制溶藻弧菌的生長(zhǎng)，其次是p-HPEA(12 800μg/mL)，其他物質(zhì)在最高溶解水平下均無(wú)抑菌作用。以抗生素作為對(duì)照發(fā)現(xiàn)，阿莫西林等抗生素在4~128μg/mL時(shí)就能夠完全抑制弧菌的生長(zhǎng)。各活性物質(zhì)的MICs值是各抗生素MICs值的2~3 200倍，對(duì)弧菌的生長(zhǎng)具有一定的抑菌作用，且TBP對(duì)弧菌的抑制作用與抗生素較為相似。因此，裂片石莼水培液中抑菌活性物質(zhì)種類(lèi)豐富，多種物質(zhì)協(xié)同作用更有助于控制病原菌生長(zhǎng)。如有研究表明來(lái)自巨型豬草的正辛醇和乙酸正辛酯等脂肪醇和酯類(lèi)化合物對(duì)多種病原菌體具有協(xié)同抗菌活性。香芹酚和1，8-桉葉素聯(lián)合使用對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌、嗜水氣單胞菌和熒光假單胞菌的抑制具有協(xié)同作用。Zhang等研究結(jié)果也表明Reuterin和兒茶素聯(lián)合使用對(duì)變形鏈球菌的生長(zhǎng)、生物膜的表達(dá)具有協(xié)同抑制作用。
表3優(yōu)勢(shì)差異代謝物和抗生素對(duì)溶藻弧菌的MIC(μg/mL)
采用PCA進(jìn)一步對(duì)裂片石莼水培液的差異化合物進(jìn)行分析(圖5)，PC1為52.3%，PC2為16.1%，總貢獻(xiàn)率達(dá)到68.4%。對(duì)照組人工海水位于第二象限，與實(shí)驗(yàn)處理組(TA1~TD1、TA3~TD3)分布范圍較遠(yuǎn)，表明裂片石莼水培液中含有豐富的化合物。TA1~TD1(第二、三、四象限)與TA3~TD3(第一、二、四象限)的距離較遠(yuǎn)，表明隨著水培液培養(yǎng)時(shí)間的增加，化合物濃度增加。在PC1水平上，TA1~TC1的距離較近，TC1~TD1相距較遠(yuǎn)，表明在培養(yǎng)1 d的裂片石莼水培液下，低密度(1.25~5 g/L)的水培液對(duì)化合物濃度影響不大，高密度(10 g/L)可以增加水培液中化合物的濃度。TA3在第二象限，在PC1水平上與TB3~TD3相距較遠(yuǎn)，表明在培養(yǎng)3 d的裂片石莼水培液下，提高水培液密度可以增加化合物的濃度。樣本TD1、TD3(第四象限)與其他樣本(第一、二、三象限)的距離最遠(yuǎn)，進(jìn)一步表明10 g/L的水培液對(duì)化合物濃度的影響最大。這些結(jié)果表明，培養(yǎng)時(shí)間和密度對(duì)水培液中化合物濃度具有一定的影響。培養(yǎng)相同的時(shí)間，在培養(yǎng)密度(1.25~5 g/L)較低時(shí)，培養(yǎng)密度對(duì)水培液中化合物的濃度影響較小，而提高培養(yǎng)密度(10 g/L)能夠增加水培液中化合物的濃度。在10 g/L的培養(yǎng)密度下，第3 d的裂片石莼水培液中化合物的濃度高于第1 d。
圖5不同條件下裂片石莼水培液中差異化合物的PCA分析
注:PC1:第一主成分;PC2:第二主成分;A:1.25 g/L;B:2.5 g/L;C:5 g/L;D:10 g/L;T:實(shí)驗(yàn)組;Control:對(duì)照組;1:第1 d;3:第3 d
不同條件方式下，裂片石莼含有的活性物質(zhì)具有一定的差異。營(yíng)養(yǎng)鹽、鹽度和溶解氧等條件能夠影響裂片石莼分泌酚類(lèi)物質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)酚類(lèi)物質(zhì)的產(chǎn)生具有促進(jìn)作用，而溶解氧和鹽度對(duì)其具有消極的影響。海藻次級(jí)代謝產(chǎn)物和抗氧化活性隨季節(jié)發(fā)生變化，高氧濃度的強(qiáng)光照可導(dǎo)致藻類(lèi)產(chǎn)生必需的抗氧化化合物。不同季節(jié)褐藻中巖藻黃質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異主要是由于光照和溫度波動(dòng)造成的。本研究中，不同密度及持續(xù)光照的培養(yǎng)時(shí)間也能夠影響裂片石莼活性物質(zhì)的分泌，高密度的裂片石莼水培液隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加可以有效促進(jìn)活性物質(zhì)的產(chǎn)生。Singpoonga等研究表明蛹蟲(chóng)草的活性物質(zhì)腺苷和蟲(chóng)草素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在培養(yǎng)第1周到第7周顯著增加。活性物質(zhì)的產(chǎn)生是一種持續(xù)釋放的過(guò)程，這與本研究結(jié)果一致。綜上所述，活體海藻可持續(xù)釋放多種抑菌活性物質(zhì)，在控制海水養(yǎng)殖環(huán)境病原菌污染方面具有重要意義。
3、結(jié)論
本研究從不同養(yǎng)殖場(chǎng)的水產(chǎn)養(yǎng)殖樣品中分離出6株耐藥弧菌，其中3株溶藻弧菌和Vp.W1具有阿莫西林、氨芐青霉素和哌拉西林三重耐藥性，Vs.W2和Vm.R3則有阿莫西林和氨芐青霉素雙重耐藥性。裂片石莼水培液對(duì)各弧菌具有不同的抑制作用，當(dāng)與弧菌共培養(yǎng)12 h時(shí)，各弧菌在10 g/L抑制效果較好;Vp.W1、Vs.W2和Vm.R3在培養(yǎng)3 d(64%~100%)的裂片石莼水培液(1.25~10 g/L)作用下抑制效果顯著高于第1 d(1.32%~39.42%);溶藻弧菌在培養(yǎng)1 d和3 d的裂片石莼水培液作用下抑制效果差異不顯著，抑制率均不超過(guò)35%。此外，培養(yǎng)時(shí)間和密度對(duì)水培液中的化合物濃度有一定的影響，培養(yǎng)3 d的水培液可以增加化合物的濃度，且高密度(10 g/L)的水培液對(duì)化合物濃度影響最大。裂片石莼水培液含有多種化合物，包括酸類(lèi)、醇酚類(lèi)、醛酮類(lèi)、烷烴和芳香烴、雜環(huán)、酯類(lèi)等，以MEHP、Acetal、p-HPEA和TBP較為凸顯。
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