豨薟草果實(shí)內(nèi)生細(xì)菌分離、鑒定、生長(zhǎng)特性、抑菌效果及藥敏分析（二）
2結(jié)果
2.1內(nèi)生細(xì)菌的分離及抑菌效果
如表1所示，從豨薟草果實(shí)中共分離得到15株內(nèi)生細(xì)菌，其中具有抑菌活性的8株，較明顯的3株，編號(hào)為C-2、C-4、C-5-1，尤以菌株C-5-1的效果最好，對(duì)提供的幾種病原細(xì)菌均顯示出一定的抑制作用（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和大腸埃希菌中度敏感以上），圖1為菌株C-5-1對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌活性。說(shuō)明該菌株是一種廣譜的抗感染細(xì)菌且效果顯著，具有較高的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景。因此，本研究后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展就是以C-5-1為實(shí)驗(yàn)菌株。
表1豨薟草果實(shí)內(nèi)生拮抗細(xì)菌的抑菌篩選
圖1菌株C-5-1（A、C）和C-6（B、D）對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌效果
2.2菌株C-5-1的鑒定分析
光學(xué)顯微鏡染色觀察，菌株C-5-1的細(xì)胞呈桿狀，芽孢側(cè)生。革蘭氏染色結(jié)果可變，對(duì)數(shù)期時(shí)染色結(jié)果為陽(yáng)性，穩(wěn)定期時(shí)變?yōu)殛幮浴?
通過(guò)表2所得的16項(xiàng)生理生化試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，依據(jù)《伯杰氏細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，判斷該菌株可能是側(cè)孢短芽孢桿菌（Brevibacillus laterosporus）。
以菌株C-5-1的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增和測(cè)序獲得了16S rRNA基因的部分片段（1 438 bp），NCBI GenBank登錄號(hào)為KX170837。選擇同源性較近的菌株與C-5-1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示（圖2）該菌株與側(cè)孢短芽孢桿菌的同源關(guān)系最近。結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定結(jié)果，確定為側(cè)孢短芽孢桿菌，該菌株被命名為C-5-1。
表2 C-5-1部分生理生化特征
圖2基于16S rRNA基因序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)
2.3藥敏分析
藥敏試驗(yàn)結(jié)果（表3）表明，5種指示菌對(duì)氨芐西林均完全耐藥，而本研究所分離得到的菌株C-5-1對(duì)氨芐西林是高度敏感的。因此，在后續(xù)摸索抗菌代謝物的純化方案中，可以向LB固體培養(yǎng)基中加入適宜濃度的氨芐西林，以抑制發(fā)酵液和純化液中菌株C-5-1的生長(zhǎng)，而指示菌（銅綠假單胞菌）正常生長(zhǎng)。
表3五種指示菌與側(cè)孢短芽孢桿菌C-5-1的藥敏分析
2.4菌株C-5-1的生長(zhǎng)特性
分別測(cè)定細(xì)菌在不同酸堿度和鹽度的生長(zhǎng)特性，從而為該菌株的進(jìn)一步培養(yǎng)和發(fā)酵利用提供依據(jù)。結(jié)果（表4）顯示，側(cè)孢短芽孢桿菌C-5-1在低pH環(huán)境中耐受性有限，在pH≤5.0時(shí)幾乎沒(méi)有生長(zhǎng)，但在pH≥7.0時(shí)生長(zhǎng)良好，并且隨著pH值的升高，菌體量也一直在增加，這說(shuō)明該菌株耐堿不耐酸。菌株C-5-1在NaCl鹽度≤5%（相當(dāng)于50 g/L）時(shí)正常生長(zhǎng)，但隨著鹽度的增加該菌株的生長(zhǎng)受到了一定的抑制，當(dāng)鹽度≥15%時(shí)，其生長(zhǎng)受到了完全抑制甚至死亡。這是因?yàn)椴煌}度能形成不同滲透壓環(huán)境，造成細(xì)胞不同程度的脫水，從而降低生長(zhǎng)速率，甚至失活。
表4側(cè)孢短芽孢桿菌C-5-1生長(zhǎng)特性值
2.5菌株C-5-1抗菌代謝產(chǎn)物的初步純化
由表5可知，側(cè)孢短芽孢桿菌C-5-1發(fā)酵液的乙酸乙酯相和水相都有明顯的抑菌圈，直徑分別為（28.3±0.8）mm和（29.9±0.5）mm，指示菌為銅綠假單胞菌，這說(shuō)明該菌株不止產(chǎn)生一種抗菌物質(zhì)。后又通過(guò)超濾離心管對(duì)二者進(jìn)行了純化，研究表明這兩種抗菌代謝產(chǎn)物的分子量均小于2 000。
表5側(cè)孢短芽孢桿菌C-5-1純化液的抑菌活性
3討論
內(nèi)生細(xì)菌在適宜生境中能通過(guò)發(fā)酵獲得大量目的活性產(chǎn)物，從而可以緩解某些藥用植物資源短缺、生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、生態(tài)系統(tǒng)損害等現(xiàn)象，并能為新藥開(kāi)發(fā)與瀕危藥用植物保護(hù)等難題提供重要思路。由于病原菌耐藥性增加等問(wèn)題的日益凸顯，使得尋求天然、高效、綠色的替代品更加重要。
側(cè)孢短芽孢桿菌最初是由Laubach于1916年從淡水中分離得到，并根據(jù)它的形態(tài)及生理生化特性將其歸為芽孢桿菌屬，到1996年，Shida等按近代生物分類學(xué)將其重新劃分為短芽孢桿菌屬。據(jù)報(bào)道側(cè)孢短芽孢桿菌具有廣譜抗菌活性，尤其是對(duì)細(xì)菌和真菌。近期的全基因組測(cè)序結(jié)果表明，側(cè)孢短芽孢桿菌還具有產(chǎn)生聚酮化合物和非核糖體肽等多種抗感染藥物的潛力，因此其醫(yī)用功能潛力巨大。Barsby等從巴布亞新幾內(nèi)亞海岸熱帶海水中分離得到一株側(cè)孢短芽孢桿菌，能產(chǎn)生聚酮類Basiliskamides等多種化合物，可以有效抑制大腸埃希菌和白色念珠菌。同樣也是從海洋中分離得到的菌株P(guān)NG276能明顯地抑制腸球菌的生長(zhǎng)。Yang等從菌株OSY-I1分離到一種能抗革蘭氏陽(yáng)性菌生長(zhǎng)的脂肽抗生素Brevibacillin。本研究從豨薟草果實(shí)中獲得一株具有較強(qiáng)抗感染活性的耐堿側(cè)孢短芽孢桿菌C-5-1，并且結(jié)合其代謝產(chǎn)物的物化性質(zhì)，推測(cè)它們可能是新型抗菌物質(zhì)。預(yù)示著該菌株具有非常高的開(kāi)發(fā)價(jià)值，極可能取代部分抗生素進(jìn)行應(yīng)用。
由于后續(xù)對(duì)菌株C-5-1抗感染活性的研究是以其代謝產(chǎn)物為主，為了降低成本和縮短時(shí)間，本研究開(kāi)展了實(shí)驗(yàn)菌株C-5-1與5種指示菌的藥敏試驗(yàn)，以期篩選到對(duì)C-5-1高度敏感而對(duì)指示菌耐藥的抗生素，結(jié)果表明氨芐西林能滿足此要求。在測(cè)量抑菌活性時(shí)，首先向熔化的固體培養(yǎng)基中加入適宜濃度的氨芐西林，然后指示菌涂布于平板表面，并將待測(cè)樣品直接置于平板中央0.8 cm的孔中。如果按傳統(tǒng)做法，樣品需要經(jīng)過(guò)孔徑為0.22μm的濾膜過(guò)濾后再加入。
4結(jié)論
豨薟草可作為優(yōu)良微生物資源的來(lái)源，從而為開(kāi)發(fā)新型天然抗感染藥物提供寶貴的資源。
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