基于MALDI-TOF微生物質譜菌種快速鑒定技術，助力微生物鑒定和污染溯源調查
近日，上海市食品藥品檢驗研究院宋明輝博士發(fā)表在《Frontiers in Microbiology》期刊上的論文《A comprehensive technology strategy for microbial identification and contamination investigation in the sterile drug manufacturing facility—a case study》受到了行業(yè)內廣泛關注和討論[1]。該文章詳細闡述了一種創(chuàng)新的綜合技術策略-基于MALDI-TOF微生物質譜菌種快速鑒定技術和全基因組測序菌株分型技術，為制藥企業(yè)在無菌藥品生產車間中進行微生物鑒定和污染溯源調查提供了全新的視角和有效的技術手段。文章的發(fā)表對于提高制藥企業(yè)的生產質量控制水平、保障藥品安全具有重要意義，為行業(yè)內相關問題的解決提供了寶貴的參考和借鑒。
圖1.菌株監(jiān)測和溯源完整過程的示意圖
前言：
微生物污染一直是藥品制造面臨的嚴峻挑戰(zhàn)。藥品，特別是注射劑和眼科藥品等高風險無菌產品，一旦在生產和儲存過程中發(fā)生污染，可能會造成不可逆轉的損害，嚴重情況下，甚至會損害患者的健康和生命。統(tǒng)計表明，在2012年至2019年期間，美國FDA注冊藥品的所有召回中，有50%以上與微生物污染有關[2，3]。
了解藥品生產過程中環(huán)境微生物的類型和分布是藥企過程監(jiān)測計劃的重要部分，高效的微生物鑒定和表征策略對于有效的微生物污染控制至關重要。
目的：
本研究旨在基于基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜，輔以測序技術，建立無菌藥品生產過程中微生物鑒定和污染調查的綜合策略，以監(jiān)測污染菌并分析其分布特征和模式。
方法：
對無菌藥品生產過程涉及的各個要素，包括原材料、人員、環(huán)境和生產用水系統(tǒng)，進行采樣和菌株的分離培養(yǎng)，通過MALDI Biotyper質譜進行菌種鑒定，輔以測序技術進行菌株鑒定和分型，再對檢測結果進行分析和評估。
結果：
從無菌藥品生產車間歷時3個月的環(huán)境監(jiān)測項目中，共分離出292個菌株。細菌污染分布如表1所示，最大的污染源是生產環(huán)境（212株），占所有分離菌株的70%以上，其次是水系統(tǒng)（39株）。
表1.不同地點微生物的菌株、菌種和菌屬數(shù)量分布。
根據(jù)菌株的分離部位、生長特征和菌落形態(tài)等信息，排除可能的重復菌株后，剩余241個菌株。鑒定結果表明，241個菌株分屬于44個菌屬的94個菌種。菌株數(shù)排名前5的主要污染菌約占菌株總數(shù)的70%，分別屬于葡萄球菌（40.25%）、微球菌（11.20%）、芽孢桿菌（8.30%）、放線菌（5.81%）和類芽孢桿菌（4.56%）。19個優(yōu)勢菌種占所有94個菌種的64%，包括占明顯優(yōu)勢的9種葡萄球菌，其中出現(xiàn)10次以上的有科氏葡萄球菌（33）、表皮葡萄球菌（27）和人葡萄球菌（10）。
科氏葡萄球菌出現(xiàn)了33次，分別出現(xiàn)于環(huán)境（A級3次、B級7次、C級20次）、人員（2次）和原材料（1次）中，證明其在整個過程中廣泛存在。科氏葡萄球菌出現(xiàn)于環(huán)境監(jiān)測的兩個關鍵區(qū)域，大多數(shù)（28/33）科氏葡萄球菌分離于制劑生產區(qū)，只有5個來自原料藥生產區(qū)。在從制劑生產區(qū)分離的28個科氏葡萄球菌株中，有兩個來自A級潔凈區(qū)。
圖2.不同監(jiān)測地點優(yōu)勢菌屬的分布
為了確定其來源，作者開發(fā)了一種更具鑒別性的全基因組SNP分型方法來追蹤傳播途徑。cgMLST將28個分離菌株分為11種基因型（SID=0.765），其中包含兩個以上菌株的有A、B和C三個型。從制劑生產區(qū)的A級關鍵區(qū)域——層流柜中分離到的菌株H71和13個近緣分離株（20到172個SNP差異）被聚類為A型。菌株H71與C級區(qū)域幾個采樣點分離的菌株密切相關，即氣閘（G2、G1、G32、G39、F28）、封蓋室（H28、G30 F30）、走廊（F8、G19）等，這表明A級表面的污染很可能來自潔凈度級別較低的C級區(qū)域，通過物質、空氣或人員流動進行傳播。在A級區(qū)域發(fā)現(xiàn)的菌株K6與從工作人員右手手腕上分離的菌株H66（38個SNP）密切相關，同屬于B型，表明通過不良的人員操作或流動引入污染的可能性很高。
圖3.28株污染菌科氏葡萄球菌的wgSNP分型結果。
結論
MALDI Biotyper微生物質譜鑒定系統(tǒng)一天內即可完成所有菌株的鑒定，在菌種水平和菌屬水平的鑒定能力分別為75.8%和95.4%，不僅速度快、通量高，而且準確性和可靠性高，有望成為例行環(huán)境監(jiān)測的一線工具。
從原料和環(huán)境表面分離出來的產孢菌分別為58%和32%，說明了原料質量控制和轉移消毒的重要性。
基于SNP的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，本案例中的環(huán)境污染主要與人員流動相關。菌株分型結果為后續(xù)的風險評估提供了準確可靠的信息，為采取有效的預防和糾正措施提供了很好的技術支撐。
本研究創(chuàng)新性地建立了主要基于MALDI Biotyper質譜菌種鑒定技術和全基因組測序菌株分型技術的無菌藥品生產過程中微生物鑒定和污染調查的綜合策略。該策略將促進制藥行業(yè)開發(fā)改進生產和環(huán)境控制的流程，并指導如何為優(yōu)化質控計劃提供更合理可靠的證據(jù)。
編者注：
在本研究中，布魯克MALDI Biotyper微生物質譜快速鑒定系統(tǒng)在該綜合技術策略中發(fā)揮著快速高效的作用。即便該研究中微生物質譜鑒定采用的是2019年的數(shù)據(jù)庫，但在微生物鑒定方面已經(jīng)具有很高的準確率。而且，布魯克每年都在持續(xù)更新數(shù)據(jù)庫，隨著MALDI Biotyper數(shù)據(jù)庫的不斷更新，其鑒定范圍和準確率還會持續(xù)提高。
近期，已有研究把IR Biotyper全自動紅外光譜微生物分型溯源系統(tǒng)應用于藥品生產企業(yè)中的溯源、質控以及WGS分析的初篩工作。
可以相信，布魯克MALDI Biotyper與IR Biotyper相結合的監(jiān)測方案在制藥微生物監(jiān)測領域中，因其具備微生物快速鑒定、分型和溯源分析的能力，同時具有檢測速度快、成本低以及可實現(xiàn)全面監(jiān)測等優(yōu)勢，能夠為制藥企業(yè)提供更為有效的微生物監(jiān)測解決方案，進而確保藥品生產的安全性與質量。