低水分活度、低pH值環(huán)境、檸檬酸對(duì)芽孢桿菌生長(zhǎng)抑制作用
芽孢桿菌是一種常見(jiàn)的導(dǎo)致食源性疾病的菌種，當(dāng)生存條件惡劣時(shí)，它們能以孢子的形態(tài)繼續(xù)存活，因而一般的食品清潔加工手段很難將其完全清除，尤其是蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)。
芽孢桿菌能夠在食物中產(chǎn)生嘔吐毒素(Cereulide)，該毒素非常穩(wěn)定，對(duì)于酸、堿(pH值2～11穩(wěn)定)和熱(121℃，30 min穩(wěn)定)都具有極高的耐受性。當(dāng)人體感染了大量的芽孢桿菌時(shí)，它們會(huì)在小腸內(nèi)產(chǎn)生腸毒素從而導(dǎo)致人體發(fā)生嘔吐和腹瀉的癥狀。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，引起食物中毒的事件中，芽孢桿菌的數(shù)量均達(dá)到了106～109CFU·mL-1，因此，控制芽孢桿菌的生長(zhǎng)繁殖是避免食物中毒的關(guān)鍵。
雖然已經(jīng)有不少文獻(xiàn)就芽孢桿菌的特性及其生存條件作出了指導(dǎo)性的界定，但均集中在對(duì)蠟樣芽孢桿菌特性的了解、分析和應(yīng)用上，很少涉及其它芽孢桿菌的菌種。而真正應(yīng)用于食品安全分析的菌種卻是毒性相對(duì)較小的菌種，如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)和短小芽孢桿菌(Bacilluspumilis)等。因此，作者選取了14株常見(jiàn)芽孢桿菌，在此對(duì)其生存條件進(jìn)行具體分析，擬為進(jìn)一步的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)提供指導(dǎo)。
1實(shí)驗(yàn)
1.1菌株
14株芽孢桿菌：2株Bacilluscirculans(BC1，BC2)，2株Bacillusmegaterium(BM1，BM2)，2株Bacillussubtilis(BS1，BS2)，1株Bacilluscereus(BAC01)，3株Bacilluspumilis(BPU1，BPU2，BPU3)，1株Brevibacillusbrevis(BBB1)，1株Bacilluscoagulans(BCO1)，1株Bacilluslichenformis(BLI1)和1株Bacilluspolymyxa(BPO1)。BC1、BM1和BPU1購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，其余均由Juan L.Silva(Mississippi State University，MS，USA)博士提供。
1.2細(xì)菌細(xì)胞的處理
所有的菌株都在腦心浸出液肉湯(BHI Broth，Difco)中于30℃、有氧條件下復(fù)活復(fù)壯。實(shí)驗(yàn)前均須經(jīng)過(guò)24 h的培養(yǎng)，然后在離心機(jī)(Sorvall®Biofuge Fresco)1000×g轉(zhuǎn)速(4℃，2 min)下用0.85%的鹽水清洗2次。分別在培養(yǎng)0 d、第1 d、第3 d、第7 d和第14 d取樣，使用Tryptic Soy Agar(TSA，Becton Dickinson)平板記錄芽孢桿菌的活菌數(shù)(CFU·mL-1)。
1.3低水分活度環(huán)境對(duì)芽孢桿菌抑制作用的研究
將14株芽孢桿菌用0.85%鹽水離心(1000×g，4℃，2 min)清洗2次，然后各取10μL分別接入5種不同水分活度(AW，0.86、0.87、0.89、0.92、0.94；由固體氯化鈉和甘油調(diào)節(jié)AW)的10 mL BHI培養(yǎng)基中，在0 d、第1 d、第3 d、第7 d和第14 d取樣觀(guān)察芽孢桿菌的生長(zhǎng)情況。
1.4低pH值環(huán)境對(duì)“酸適應(yīng)”芽孢桿菌抑制作用的研究
將14株芽孢桿菌接入10 mL BHI培養(yǎng)基(由1 mol·L-1鹽酸調(diào)pH值至5.0)中，在30℃、有氧環(huán)境下培養(yǎng)24 h，即得“酸適應(yīng)”芽孢桿菌。將“酸適應(yīng)”芽孢桿菌用0.85%鹽水離心(1000×g，4℃，2 min)清洗2次，然后各取10μL分別接入5種不同pH值(3.4、3.8、4.0、4.4、4.6；由1 mol·L-1鹽酸調(diào)pH值)的10 mL BHI培養(yǎng)基中，在0 d、第1 d、第3 d、第7 d和第14 d取樣觀(guān)察芽孢桿菌的生長(zhǎng)情況。
1.5檸檬酸對(duì)“適應(yīng)”芽孢桿菌抑制作用的研究
將14株芽孢桿菌接入10 mL BHI培養(yǎng)基(由1 mol·L-1檸檬酸調(diào)pH值至5.0)中，在30℃、有氧環(huán)境下培養(yǎng)24 h，即得“適應(yīng)”芽孢桿菌。將“適應(yīng)”芽孢桿菌用0.85%鹽水離心(1000×g，4℃，2 min)清洗2次，然后各取10μL分別接入5種不同pH值(3.4、3.8、4.0、4.4、4.6；由1 mol·L-1檸檬酸調(diào)pH值)的10 mL BHI培養(yǎng)基中，在0 d、第1 d、第3 d、第7 d和第14 d取樣觀(guān)察芽孢桿菌的生長(zhǎng)情況。
2結(jié)果與討論
2.1低水分活度環(huán)境對(duì)芽孢桿菌的抑制作用(圖1)
a～e，AW:0.86，0.87，0.89，0.92，0.94
由圖1可看出，芽孢桿菌對(duì)于低水分活度環(huán)境的耐受性有限：AW在0.86時(shí)，所有的菌株都沒(méi)有生長(zhǎng)，BC2和BM2不能存活；AW在0.87時(shí)，BLI1、BC1和BPU1可以生長(zhǎng)，BC2、BM2和BAC01不能存活；AW在0.89時(shí)，除了BPO1保持菌落數(shù)不變，BC2、BM2和BAC01的菌落數(shù)下降，其余菌株都能有不同速率的生長(zhǎng)；AW在0.92時(shí)，除了BM2保持菌落數(shù)不變，BC2和BAC01的菌落數(shù)下降，其余菌株都能生長(zhǎng)；AW在0.94時(shí)，所有菌株都能生長(zhǎng)。
2.2低pH值環(huán)境對(duì)“酸適應(yīng)”芽孢桿菌的抑制作用(圖2)
由圖2可看出，芽孢桿菌對(duì)于低pH值環(huán)境的耐受性有限：pH值<4.0時(shí)，所有的菌株都沒(méi)有生長(zhǎng)，BC2、BAC01和BBB1不能存活；pH值為4.4時(shí)，BS1、BBB1和BCO1可以生長(zhǎng)，BC2和BAC01不能存活；pH值為4.6時(shí)，BS1、BS2、BBB1、BCO1、BC1、BM1、BPU1和BPO1可以生長(zhǎng)，BC2和BAC01不能存活。
a～e，pH值：3.4，3.8，4.0，4.4，4.6
2.3檸檬酸對(duì)“適應(yīng)”芽孢桿菌的抑制作用(圖3)
由圖3可看出，使用檸檬酸來(lái)調(diào)節(jié)pH值，加強(qiáng)了對(duì)芽孢桿菌的抑制效果，對(duì)Bacillusmegaterium的抑制效果尤其明顯：pH值<4.4時(shí)，所有的菌株都沒(méi)有生長(zhǎng)，BM1、BM2和BBB1不能存活；pH值為4.6時(shí)，BS2可以生長(zhǎng)，BM1和BM2不能存活。
a～e，pH值：3.4，3.8，4.0，4.4，4.6
3結(jié)論
將14株芽孢桿菌在不同水分活度和pH值條件下培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，14株芽孢桿菌對(duì)低水分活度(<0.86)和低pH值(<4.4)的耐受性均有限，耐受性強(qiáng)弱(依次為)：
(1)對(duì)于水分活度(AW)：BLI1>BC1>BPU1>BM1>BS1，BS2，BPU2，BPU3，BBB1>BCO1>BPO1>BM2>BC2，BAC01。
(2)對(duì)于pH值：BS1，BCO1>BBB1>BS2，BC1，BM1，BPU1，BPO1>BM2，BPU2，BPU3，BLI1>BAC01，BC2。
(3)對(duì)于檸檬酸：BS2>BC1，BC2，BS1，BAC2，BPU1，BPU2，BPU3，BPO1，BCO1>BLI1>BBB1>BM1，BM2。
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