基于刃天青微量板法檢測沙門氏菌抗生素的耐藥性（二）
1.5刃天青工作條件的優化
用NB肉湯將沙門氏菌進行連續梯度稀釋，分裝96孔培養板中，每孔加入100μL，終濃度分別為7.5×106、7.5×105、7.5×104、7.5×103、7.5×102、7.5×10 CFU/mL，菌液濃度列間遞減;同時每孔加入用NB肉湯稀釋的不同濃度刃天青溶液100μL，終濃度為1.600、0.800、0.400、0.200、0.100、0.050、0.025 mmol/L，刃天青濃度行間遞減。設無刃天青含菌的NB肉湯為陽性對照，無菌含刃天青的NB肉湯為陰性對照，37℃恒溫培養箱中培養12 h，每隔1 h觀察顏色變化，檢測熒光值，熒光激發波長為530 nm，發射波長為590 nm，并記錄熒光數據。該試驗測量熒光值和觀察顏色變化來評價藥物的抑菌效果，選用變為粉紅色的時間為試驗所需測試時間，并且將能明顯顯示細菌生長的刃天青濃度選為工作濃度。
1.6沙門氏菌生長動態觀察
取培養的沙門氏菌，用NB肉湯稀釋成不同濃度7.5×106、7.5×105、7.5×104、7.5×103、7.5×102、7.5×10 CFU/mL，分裝于96孔板中，100μL/孔，再每孔加入100μL的工作濃度刃天青溶液，37℃恒溫培養10 h，每隔1 h觀察結果并同時檢測熒光值。
1.7刃天青微量板藥敏試驗
將NB肉湯稀釋的刃天青溶液100μL加到無菌的96孔培養板中，將抗生素加入第1孔，1～11孔進行梯度稀釋，第12孔不加抗生素作為陽性生長對照。向每孔中加100μL培養的沙門氏菌菌懸液，在37℃恒溫培養箱中孵育。選擇對5種抗生素耐藥或敏感的6株沙門氏菌進行藥敏試驗，根據顏色變化及熒光值來判斷沙門氏菌是否生長及其對所試抗生素的敏感性。
1.8刃天青微量板的應用
將蛋洗凈并浸泡在75%乙醇溶液中后，將蛋清和蛋黃在無菌條件下移入無菌均質袋中，并用均質器打漿2 min以制備懸浮液。通過將25 mL雞蛋混合物添加到175 mL營養肉湯中來制備1∶10樣品稀釋液。用該稀釋液將鼠傷寒沙門氏菌稀釋成7.5×106 CFU/mL，然后按照“1.7”方法進行藥敏試驗。另取樣品100μL，涂布NA瓊脂平板，37℃培養24 h觀察是否雜菌污染。
2結果與分析
2.1細菌濃度的確定
為了便于細菌定量檢測，用細菌濁度儀測定沙門氏菌濁度，取定量稀釋液涂布NA瓊脂平板，培養24 h后進行菌落計數。經菌落計數，計算出0.5 MCF菌液對應的細菌培養物的菌落數為4.15×108 CFU/mL。
2.2刃天青工作條件優化
該試驗測試沙門氏菌濃度與刃天青濃度的熒光值和顏色變化，根據其變化來優化測試條件。其中挑選3個時間點來進行結果說明。當培養3 h時，7.5×106 CFU/mL濃度細菌可使0.025～0.200 mmol/L刃天青變粉紅色。當培養6 h時，細菌濃度≤103 CFU/mL，均不能使所用7種刃天青濃度變色，這顯示沙門氏菌沒有生長;當細菌濃度≥104 CFU/mL，0.025～0.400 mmol/L刃天青可以顯示沙門氏菌生長，≥0.800 mmol/L刃天青的顯色時間相對滯后，其中高濃度細菌（7.5×106 CFU/mL）在全濃度刃天青溶液中都變粉紅色。培養12 h后，只有7.5×10 CFU/mL濃度的細菌在1.600 mmol/L刃天青濃度下不變色，其余濃度的細菌均可使刃天青變為粉色。熒光檢測結果所得趨勢同上。從7.5×105 CFU/mL細菌在不同刃天青濃度下隨孵育時間的熒光檢測結果（圖1）可以看出，細菌與刃天青反應2 h后熒光差異明顯，0.025～0.100 mmol/L刃天青在5 h內還原趨于飽和，0.200～0.800 mmol/L刃天青在5～6 h還原飽和;0.050～0.800 mmol/L刃天青的飽和熒光值接近，說明特定濃度細菌已被刃天青飽和或過飽和。試驗結果表明，低濃度刃天青產生的熒光信號低，反應不靈敏，而過高濃度的刃天青會導致反應時間過長且熒光檢測滯后。綜合顏色變化和熒光值，在5個變色較快的濃度中，0.100 mmol/L刃天青的顯色清晰，熒光值明顯，因此選為刃天青微量板的工作濃度。
2.3沙門氏菌的生長動態
將不同濃度的沙門氏菌在刃天青微量板上培養12 h，每隔1 h觀察結果。結果顯示（表1），當細菌濃度為7.5×102、7.5×104和7.5×105 CFU/mL時，分別培養8、6和4 h即可見沙門氏菌生長;其中細菌濃度為7.5×10、7.5×103和7.5×106 CFU/mL時，分別在10、7和2 h顯示為部分沙門氏菌生長。由此可見，刃天青微量板進行沙門氏菌藥敏試驗的判斷時間可以控制在5 h。
2.4刃天青微量板藥敏試驗
用配制好的標準濃度抗生素進行沙門氏菌藥敏試驗，結果顯示（表2），不同沙門氏菌分離株對抗生素氧氟沙星、氨芐西林、環丙沙星、美羅培南、四環素或敏感或耐藥。依據CLSI的最新判斷標準，刃天青微量板與微量肉湯稀釋法藥敏試驗得到的耐藥結果一致。這表明用刃天青微量板法可以在短時間內更為直觀地觀察到耐藥結果。但在檢測沙門氏菌對美羅培南耐藥性時發現，因為所用沙門氏菌對美羅培南均為完全敏感，可以觀察到在耐藥折點有些菌株會有極輕微的變色。
在測量菌株耐藥情況的同時，選擇性地擴大抗生素的濃度范圍，發現用刃天青微量板法得到的MIC值和微量肉湯稀釋法的MIC值會有些許差異，沙門氏菌對環丙沙星和美羅培南的耐藥性如表3所示。擴大濃度范圍后，用2種方法測得的4株菌的MIC有差異。其中3株菌在測量對美羅培南耐藥性時發現，用刃天青微量板法檢測可以得到相對應的MIC值，但用微量肉湯稀釋法檢測得到的卻為敏感，沒有確切的MIC值。這可能是因為刃天青變色敏感，更易被人肉眼和熒光檢測到，而微量肉湯稀釋法只關注培養基的渾濁程度，無法精確得到耐藥值。這間接表明刃天青微量板法比肉湯稀釋法更靈敏，對研究菌株在低濃度抗生素中的生長情況有幫助，有益于在公共衛生方面的用藥安全。
2.5刃天青微量板的應用
用氧氟沙星、氨芐西林、環丙沙星、美羅培南、四環素5種抗生素對實際樣品進行刃天青微
量板快速藥敏試驗，并同時進行微量肉湯稀釋法藥敏試驗對照，結果顯示（表4），2種藥敏試驗方法的結果具有良好的一致性。
3結論
該研究以刃天青為檢測物質，對食源性致病菌沙門氏菌的耐藥性進行檢測。所用刃天青微量板法得到的MIC與微量肉湯稀釋法進行判斷的結果具有良好的一致性，且更為靈敏、直觀，在5 h內就可以得出藥敏結果。其中肉眼觀察在實際應用中較為方便，不受試驗設備、場地的制約;熒光檢測可以更清晰地明確耐藥情況，獲得整個耐藥進程，且更為準確、客觀和結果可量化。刃天青微量板法彌補了瓊脂法等常規藥敏試驗方法無法動態檢測細菌生長情況的缺陷，其優勢在于其可清晰辨別耐藥折點，動態地檢測細菌的生長狀況，在低濃度抗生素下可以得到更為精確的耐藥值。刃天青微量板法具有簡便、快速、靈敏、經濟等優點，在檢測各種細菌對抗生素的敏感性中有顯而易見的優勢。同時刃天青法為非特異性檢測，在實際檢測中有更好的應用價值。
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