基于食淀粉乳桿菌的生長(zhǎng)曲線制備菌株胞外囊泡，且不破壞囊泡結(jié)構(gòu)
目前，對(duì)食淀粉乳桿菌胞外囊泡及其提取方法的研究和開(kāi)發(fā)尚處于空白階段。如何獲得一種高效、高純度、低成本的食淀粉乳桿菌胞外囊泡制備方法且在制備過(guò)程中不破壞囊泡結(jié)構(gòu)是目前急需解決的。
為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的至少一個(gè)問(wèn)題，從低成本、高效、高純度等方面出發(fā)綜合優(yōu)化，以食淀粉乳桿菌的生長(zhǎng)曲線為切入點(diǎn)，以特定培養(yǎng)時(shí)間擴(kuò)大菌體產(chǎn)量，結(jié)合超濾法濾過(guò)小分子蛋白等雜質(zhì)，再以超速離心法分離出胞外囊泡，從而獲得高濃度的菌源胞外囊泡。下面提供了一種高效、高純度、低成本地快速提取食淀粉乳桿菌胞外囊泡(LaEVs)且不會(huì)破壞囊泡結(jié)構(gòu)的方法，且證明由食淀粉乳桿菌分泌的胞外囊泡具有效濃度，且形態(tài)結(jié)構(gòu)完好無(wú)損。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，建議采用如下技術(shù)方案：
一種食淀粉乳桿菌胞外囊泡的制備步驟：
1、接種食淀粉乳桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，獲得含胞外囊泡的發(fā)酵菌液；
復(fù)蘇菌種后，挑取菌種于培養(yǎng)基中，放置于恒溫培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)4～8h后，以1～4wt％的接種量接種于1～3L培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)12～24h。優(yōu)選，復(fù)蘇菌種后，挑取菌種于MRS肉湯，放置于恒溫培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)6h后，以2wt％接種量接種于2L的MRS肉湯37℃培養(yǎng)18h，當(dāng)其他條件保持一致，若降低發(fā)酵液體積，則胞外囊泡的產(chǎn)量會(huì)降低。上述步驟中，接種量與培養(yǎng)時(shí)間結(jié)合食淀粉乳桿菌的生長(zhǎng)曲線，從而確定：2wt％為最佳接種量，6h為生長(zhǎng)期對(duì)數(shù)前期，18h為生長(zhǎng)期對(duì)數(shù)后期，按此步驟與條件培養(yǎng)，食淀粉乳桿菌的菌體活性與濃度較高，可最大程度提升其分泌的胞外囊泡產(chǎn)量。
2、將獲得的發(fā)酵菌液離心，去除菌體沉淀，將收集的上清液過(guò)濾，收集濾液；
具體包括：將發(fā)酵菌液以4000～6000g、4℃離心10～20分鐘，棄去菌體沉淀，將收集的上清液使用0.2～0.3μm過(guò)濾器過(guò)濾，收集濾液。優(yōu)選，將發(fā)酵菌液以5000g、4℃離心15分鐘，棄去菌體沉淀，此時(shí)所得上清液體積高，保證了胞外囊泡的高產(chǎn)量；將收集的上清液使用0.22μm過(guò)濾器過(guò)濾，收集濾液，此過(guò)濾步驟進(jìn)一步去除菌體沉淀與相似質(zhì)量的物質(zhì)，有利于可提升超濾效率，降低濾膜堵塞造成的損耗。
3、將獲得的濾液使用高級(jí)離心管離心，收集超濾液；
具體包括：將濾液使用超濾管4000～6000g、4℃離心15～60分鐘，收集超濾液。優(yōu)選，將濾液使用超濾管5000g，4℃離心30分鐘。
超濾管含有可截留大于100kDa囊泡的超濾膜。此時(shí)超濾膜可截留大于100kDa的囊泡于超濾液中，小于100kDa的物質(zhì)例如小型肽、寡核苷酸、核酸、酶等其他相似大分子將被除去，經(jīng)過(guò)超濾步驟，可有效提升制備純度。
超濾管包括濾液接收器，濾液接收器內(nèi)置樣本池，樣本池內(nèi)固定封裝膜(超濾膜)，濾液接收器的頂部與樣本池蓋進(jìn)行可拆卸連接。
超濾管為高級(jí)離心管。可理解的是，超濾管的型號(hào)及其過(guò)濾器的容積均可根據(jù)具體需要選擇。在一具體實(shí)施方式中，超濾管的過(guò)濾器的容積為15mL。利用超濾管濃縮含有胞外囊泡的液體中的胞外囊泡的離心力可為5000g。利用超濾管濃縮含有胞外囊泡的液體中的胞外囊泡的離心時(shí)間可為15-60分鐘。利用超濾管濃縮含有胞外囊泡的液體中的胞外囊泡在4℃下進(jìn)行。
4、將獲得的超濾液超速離心，將得到的沉淀重懸、過(guò)濾，獲得食淀粉乳桿菌胞外囊泡。
具體包括：將超濾液以11000～160000g、4℃超速離心1～3小時(shí)；將得到的沉淀用PBS重懸，使用0.2～0.3μm過(guò)濾器過(guò)濾，獲得食淀粉乳桿菌胞外囊泡。優(yōu)選，將超濾液以160000g，4℃超速離心2小時(shí)，此時(shí)質(zhì)量相對(duì)較重的胞外囊泡將被沉淀，其他條件保持一致，降低超速離心轉(zhuǎn)速可導(dǎo)致胞外囊泡產(chǎn)量降低；將得到的沉淀用PBS重懸，使用0.22μm過(guò)濾器過(guò)濾，去除上述過(guò)程中可能存在的菌體污染，提高分離制備試驗(yàn)的成功率。
食淀粉乳桿菌的分類(lèi)命名為L(zhǎng)actobacillus amylovorus，其保藏編號(hào)為CCTCC NO：M2023427，保藏日期為2023年3月28日，保藏單位為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏單位地址為中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)。
本次以食淀粉乳桿菌的生長(zhǎng)曲線為切入點(diǎn)，以特定培養(yǎng)時(shí)間擴(kuò)大菌體產(chǎn)量，結(jié)合超濾法濾過(guò)小分子蛋白等雜質(zhì)，再以超速離心法分離出胞外囊泡，從而獲得高濃度的菌源胞外囊泡，提供了一種高效、高純度、低成本的胞外囊泡制備方法，且不會(huì)破壞囊泡結(jié)構(gòu)。此制備的食淀粉乳桿菌胞外囊泡在疾病治療、抗菌藥物靶點(diǎn)及藥物開(kāi)發(fā)、工業(yè)發(fā)酵乳酸菌調(diào)控與動(dòng)物保健等領(lǐng)域均具有潛在應(yīng)用價(jià)值。
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