草魚呼腸孤病毒培養(yǎng)與滴度測定、及在草魚、CIK細胞上的生長特性研究（一）
草魚（Ctenopharyngodon idella）是我國的主要淡水養(yǎng)殖品種。然而各種疾病的暴發(fā)嚴重阻礙了草魚養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，如出血性疾病、細菌性腸炎和細菌性敗血癥，給草魚養(yǎng)殖戶造成了巨大經濟損失。草魚呼腸孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）是我國第1株分離鑒定的魚類病毒，也是水生呼腸孤病毒屬中致病力最強的毒株。由其引起的草魚出血病是草魚養(yǎng)殖過程中的最大病害，死亡率高達60%以上，嚴重影響了草魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。因其危害性大、流行范圍廣、發(fā)病季節(jié)長，使該病一直為我國魚類病毒病的研究重點。學者們就該病毒的流行病學、生物化學及分子生物學等進行了研究。然而國際上對GCRV的研究與哺乳動物及禽呼腸孤病毒相比還有很大差距。研究病毒在體內的復制增殖規(guī)律可進一步揭示GCRV分子致病機理，從而為該病防治奠定基礎。目前對于該病尚無有效治療方法，主要依靠疫苗預防。我國從20世紀70年代開始研究草魚出血病疫苗，研制出的組織疫苗和細胞疫苗在生產上收到了較好效果。目前在疫苗生產過程中多使用細胞來增殖病毒。GCRV在細胞上繁殖速度較快，一般培養(yǎng)2～3 d即可觀察到細胞病變（Cytopathological effect，CPE）。當前多使用CIK細胞來制備細胞疫苗，在病毒培養(yǎng)過程中多通過觀察細胞病變來收獲病毒。但這種方式并不能準確反映病毒在細胞中的增殖規(guī)律，往往錯過最佳收獲病毒時期，致使疫苗免疫效果不理想而造成經濟損失。
Real-time PCR技術具有靈敏度高、操作簡單、結果直觀、重復性好、特異性強等優(yōu)點，能夠精確分析病毒在細胞中的增殖規(guī)律，從而為生產細胞苗提供依據(jù)。為此，本研究利用建立的Real-time PCR方法，對GCRV在CIK細胞及草魚體內的增殖復制進行動態(tài)監(jiān)測，從而為GCRV致病機理研究和細胞滅活疫苗制備奠定基礎。
1材料與方法
1.1試劑材料
M199培養(yǎng)基、胰酶：Gibco公司產品；胎牛血清：購自四季青公司；M-MLV反轉錄試劑盒、Taq DNA聚合酶、dNTPs、T載體：購自TAKARA公司；Trizol Reagent：購于Invitrogen公司；DNA Marker：購自鼎國生物公司；SYBR Green熒光染料：購自TOYOBO公司；質粒抽提試劑盒、凝膠回收試劑盒：購自愛思進公司；其他試劑均為國產分析純。
1.2細胞、毒株及試驗魚
草魚腎細胞系CIK、GCRV873由本實驗室保存。用于本研究的草魚購自浙江省淡水水產研究所苗種基地，體重為10～15 g，分別置于4個體積約300 L自動充氣水循環(huán)系統(tǒng)圓柱形水缸中飼養(yǎng)，每缸放40尾，飼養(yǎng)2周，水溫保持（26±1）℃；試驗期間每天投喂顆粒性餌料2次，投餌之前先吸污換水。
1.3 Real-time PCR檢測方法的建立
1.3.1引物設計根據(jù)GenBank中GCRV 873毒株VP6蛋白編碼基因序列，應用Primer 5軟件設計特異性熒光定量引物VP6-U及VP6-L，同時針對草魚內參基因β-actin序列設計特異性引物。引物序列（表1）由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
表1 GCRV熒光定量PCR引物序列
1.3.2標準品制備收集GCRV 873毒株CIK細胞培養(yǎng)物，按照Trizol說明書抽提RNA；用隨機引物反轉錄獲得cDNA后，分別用引物VP6-U/VP6-L和β-actin-U/β-actin-L擴增病毒VP6基因及內參基因β-actin。反應程序為：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸20 s，30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。擴增產物經回收純化后，克隆于pMD-18T載體，并將陽性克隆送南京金斯瑞公司測序確認。對測序正確的陽性克隆抽提質粒，測定濃度，按公式計算質粒標準品的拷貝數(shù)：拷貝數(shù)=（質量/分子量）×6.02×1023。
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