基于體外重組雞傳染性貧血病毒生長(zhǎng)曲線研究復(fù)制效率（二）
1.2試驗(yàn)方法
1.2.1 sgRNA和供體質(zhì)粒的構(gòu)建
參考FAdV-4 HB1505毒株的fiber-2基因序列（GenBank登錄號(hào)：MZ054256.1），利用sgRNA在線設(shè)計(jì)網(wǎng)站（http://crispor.tefor.net/）設(shè)計(jì)靶向fiber-2基因的sgRNA，并克隆到lentiCRISPR v2載體上，通過(guò)測(cè)序進(jìn)行sgRNA構(gòu)建載體的驗(yàn)證。具體的sgRNA序列見(jiàn)表1，由南京擎科生物科技有限公司合成。以線性化質(zhì)粒pMD19-HAL-LoxP-RFP-LoxP-HAR為載體，以CIAV毒株T1P6基因組為模板擴(kuò)增CIAV的VP1基因，擴(kuò)增引物見(jiàn)表2。利用ClonExpress II One Step Cloning Kit通過(guò)同源重組構(gòu)建供體質(zhì)粒pMD19-HAL-CIAV-VP1-LoxP-RFP-LoxP-HAR。
1.2.2重組病毒rFAdV-4-CIAV-VP1的構(gòu)建策略
使用轉(zhuǎn)染試劑Mirus將3μg sgRNA和3μg的供體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染LMH細(xì)胞。轉(zhuǎn)染12 h后，以0.1 MOI的FA4-EGFP感染LMH細(xì)胞。感染病毒3~4 d后，用96孔板將上清液盲傳至新的LMH細(xì)胞中，通過(guò)熒光顯微鏡觀察紅色熒光簇。紅色熒光簇出現(xiàn)則表明成功構(gòu)建重組病毒。通過(guò)有限稀釋法和病毒空斑試驗(yàn)進(jìn)一步純化出攜帶RFP表達(dá)盒的重組病毒。隨后，使用轉(zhuǎn)染試劑Mirus將4μg pcDNA3.1-Cre轉(zhuǎn)染LMH細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后，以0.1 MOI將純化后的帶RFP紅色熒光的重組病毒感染LMH細(xì)胞。通過(guò)熒光顯微鏡觀察細(xì)胞，挑取無(wú)RFP表達(dá)且存在病變的LMH細(xì)胞，用有限稀釋法或病毒空斑試驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步純化，最終獲得去除RFP表達(dá)盒的重組病毒。
1.2.3重組病毒rFAdV-4-CIAV-VP1的IFA檢測(cè)
將感染重組病毒的LMH細(xì)胞用預(yù)冷的固定液（丙酮∶乙醇=3∶2）固定5 min，然后用PBS稀釋的單克隆抗體2E3和抗FAdV-4的多克隆抗體雞血清與固定的LMH細(xì)胞在37℃下共孵育45 min。PBS洗滌3次后，用羊抗鼠lgG-FITC和羊抗雞lgG-FITC與LMH細(xì)胞再共孵育45 min。PBS洗滌3次后，在倒置熒光顯微鏡下觀察有無(wú)特異性紅色和綠色熒光。
1.2.4重組病毒rFAdV-4-CIAV-VP1的Western blot檢測(cè)
用含有磷酸酶和蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液裂解感染重組病毒的LMH細(xì)胞。將細(xì)胞裂解物上清煮沸10 min后，離心5 min。經(jīng)SDS-PAGE后，將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素（NC膜）上。室溫下，用含5%脫脂乳的PBST封閉NC膜2 h后，用單克隆抗體2E3、1B5和1C9分別孵育NC膜2 h。用PBST洗滌3次后，用HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG孵育1 h。PBST洗滌3次后，用化學(xué)發(fā)光試劑顯像，利用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)成像。
1.2.5重組病毒rFAdV-4-CIAV-VP1的生長(zhǎng)曲線測(cè)定
將構(gòu)建的重組病毒和野生型FAdV-4分別以0.1 MOI劑量感染LMH細(xì)胞。2 h后換成1%維持液，在感染后24 h、48 h、72 h、96 h和120 h收取細(xì)胞上清液，使用單克隆抗體3B5進(jìn)行免疫熒光試驗(yàn)（IFA）測(cè)定每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的病毒效價(jià)。
1.3統(tǒng)計(jì)與分析
采用Reed-Muench法計(jì)算病毒的TCID50，利用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并繪制病毒的生長(zhǎng)曲線，采用Student t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性方差分析。當(dāng)P<0.05時(shí)，表示結(jié)果具有顯著性差異。
2結(jié)果與分析
2.1帶RFP的重組病毒rFAdV-4-CIAV-VP1-RFP的拯救
構(gòu)建靶向fiber-2基因的sgRNA，以CIAV毒株T1P6基因組為模板擴(kuò)增CIAV的VP1基因（見(jiàn)圖2）以及以線性化質(zhì)粒pMD19-HAL-LoxP-RFP-LoxP-HAR為模板通過(guò)同源重組構(gòu)建供體質(zhì)粒pMD19-HAL-CIAV-VP1-LoxP-RFP-LoxP-HAR。然后，按照1.2.2步驟進(jìn)行重組病毒拯救。感染模板病毒3~4 d后，將上清液繼續(xù)盲傳，通過(guò)熒光顯微鏡觀察到紅色熒光簇（見(jiàn)圖3A），表明成功拯救出帶RFP的重組病毒，命名為rFAdV-4-CIAV-VP1-RFP。隨即通過(guò)有限稀釋和病毒空斑試驗(yàn)獲得純化的重組病毒rFAdV-4-CIAV-VP1-RFP。
2.2表達(dá)VP1蛋白的重組病毒rFAdV-4-CIAV-VP1的鑒定
通過(guò)多次轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Cre，重組病毒感染的LMH細(xì)胞在熒光顯微鏡下已經(jīng)觀察不到其中的紅色熒光簇。PCR進(jìn)一步證明，通過(guò)Cre重組酶處理，成功獲得了去除rFAdV-4-CIAV-VP1-RFP中的RFP表達(dá)盒的重組病毒rFAdV-4-CIAV-VP1，PCR擴(kuò)增條帶大小均與預(yù)期一致（見(jiàn)圖4）。重組病毒rFAdV-4-CIAV-VP1的IFA和Western blot檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5和圖6。抗FAdV-4多克隆抗體雞血清能與感染rFAdV-4-CIAV-VP1的LMH細(xì)胞發(fā)生特異性反應(yīng)，出現(xiàn)綠色熒光（見(jiàn)圖5A）。同時(shí)，VP1特異性單克隆抗體2E3同樣能特異性地與感染rFAdV-4-CIAV-VP1的LMH細(xì)胞反應(yīng)，出現(xiàn)紅色熒光（見(jiàn)圖5B）。合并圖中綠色熒光和紅色熒光幾乎完全重疊（見(jiàn)圖5C）。Western blot結(jié)果顯示，VP1特異性單克隆抗體2E3能識(shí)別感染rFAdV-4-CIAV-VP1的LMH細(xì)胞中表達(dá)的VP1蛋白（見(jiàn)圖6）。上述結(jié)果表明重組病毒rFAdV-4-CIAV-VP1獲得了純化，且rFAdV-4-CIAV-VP1能有效表達(dá)VP1蛋白。
2.3重組病毒rFAdV-4-CIAV-VP1的生長(zhǎng)曲線測(cè)定
由圖7可知，rFAdV-4-CIAV-VP1在易感細(xì)胞LMH中的復(fù)制能力遠(yuǎn)低于野生型FAdV-4，Student t檢驗(yàn)顯示存在極顯著差異（P<0.001）。野生型FAdV-4病毒效價(jià)可達(dá)到10?·?TCID??/mL，而rFAdV-4-CIAV-VP1的病毒效價(jià)僅為10?TCID??/mL。
注：表示差異顯著（P<0.05），表示差異極顯著（P<0.01），表示差異極顯著（P<0.01）。
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