國內新發病原牛皰疹病毒4型(BoHV-4)qPCR鑒定、分離及一步生長曲線測定（一）
[目的]本文旨在對一種與奶牛繁殖障礙疾病有關的國內新發病原牛皰疹病毒4型(BoHV-4)進行檢測、分離與鑒定。[方法]采集我國東北地區某養牛場疑似發生BoHV-4感染牛的生殖道拭子，將陽性樣本接種HeLa細胞分離病毒，通過特異性qPCR、間接免疫熒光(IFA)及電鏡觀察等方法對分離病毒進行鑒定，并測定病毒一步生長曲線。用PCR擴增病毒gB和TK基因并進行遺傳進化分析。[結果]陽性樣本接種細胞后盲傳3代，能夠產生圓縮、聚集等皰疹病毒典型細胞病變效應(CPE)，從IFA結果觀察到感染病毒的細胞中出現明顯的特異性綠色熒光，電鏡觀察感染細胞可見直徑100～150 nm的病毒粒子，衣殼和囊膜結構清晰，將該毒株命名為TL01。其生長曲線顯示在感染后36 h達到峰值(106.3TCID50·mL-1)。PCR擴增病毒gB和TK基因并對其序列進行遺傳進化分析，發現TL01的gB基因與參考株DN599在同一分支，屬于基因2型;TL01的TK基因與參考株Movar33/63同屬于基因1型。[結論]本研究成功分離出1株BoHV-4毒株，為深入研究BoHV-4的生物學特性和流行病學提供參考。
引言
牛皰疹病毒4型(bovine herpesvirus 4，BoHV-4)屬于皰疹病毒科丙型皰疹病毒亞科。常與牛的生殖系統疾病相關，主要致病癥狀包括流產、生殖道皰疹、產后子宮拉傷及配種障礙等。此外，BoHV-4也會與其他病原體混合感染引起產后疾病或慢性子宮炎，造成生產性能下降。
國外最早在20世紀60年代報道該病毒。Bartha等首次從匈牙利患有呼吸系統疾病和結膜炎的犢牛身上分離出該毒株，被命名Movar33/63。Mohanty等在美國新澤西州從有呼吸系統臨床癥狀的牛鼻拭中分離出1株類似的病毒，命名為DN599。隨后在阿根廷、西班牙、埃及等國家報道臨床分離株。該病毒能夠從無臨床癥狀的動物身上分離，也能夠從具有各種生殖系統疾病癥狀或者患有潰瘍性乳腺炎和皮膚病變的牛身上分離。但在我國直到2021年才首次報道BoHV-4的存在，目前對該病毒在我國流行情況及毒株特性的研究仍十分缺乏。BoHV-4不僅可在常見的MDBK細胞內復制，而且可以在人類細胞系中復制，例如人胚胎肺細胞和HeLa細胞。
BoHV-4病毒顆粒較大(直徑150～200 nm)，是有囊膜的二十面體粒子，基因組大小約144 kb。根據限制性內切酶圖譜，在初期將BoHV-4分為2種基因型:Movar33/63-Like型和DN599-Like型。2012年，研究人員對從阿根廷流產奶牛的宮頸陰道黏液中分離出的BoHV-4毒株進行分析時發現，MGA1075株和07435株具有相似的核酸內切酶圖譜，但與Movar33/63-Like型和DN599-Like型均具有較大差異，因此新定義了基因3型，揭示了其復雜的遺傳背景。研究發現，基于該病毒的糖蛋白(glycoprotein B，gB)和胸苷激酶(thymidin kinase，TK)基因的序列差異性，繪制出毒株的分子遺傳進化樹，表明gB和TK基因均可用于該病毒的基因分型，基于TK基因的進化樹體系可以提供更加準確的基因分型。
本研究通過對東北地區某牧場采集到的樣品進行檢測與病毒分離，鑒定后以gB和TK基因為靶標進行系統發育分析，以獲得該分離株的分子遺傳進化信息，為該病毒的流行病學分析提供資料以及為國內BoHV-4的診治和預防提供參考。
1材料與方法
1.1材料
生殖道拭子采自東北地區某牧場出現生殖道皰疹和繁殖障礙的病牛;HeLa細胞、BoHV-4 gB小鼠多克隆抗體由南京農業大學世界動物衛生組織豬鏈球菌病參考實驗室保存。qPCR反應酶購自青島立見生物科技有限公司。PCR擴增高保真酶、DNA/RNA磁珠法提取試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。細胞培養基DMEM購自武漢普諾賽生物科技有限公司。
1.2引物設計及合成
使用本實驗室前期設計的BoHV-4、BoHV-1、BVDV(牛病毒性腹瀉病毒)的qPCR引物;同時根據GenBank中的BoHV-4全基因組序列，設計擴增gB和TK基因的特異性PCR引物。引物信息見表1，引物均由生工生物科技有限公司合成。
表1本試驗所用的引物信息
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