辣木籽提取物制備、對蠟樣芽孢桿菌的抑制作用及在在液態(tài)乳中的應用（一）
辣木（Moringaoleifera），辣木科辣木屬植物，具有豐富的藥用和食用價值，廣泛種植于我國的云南、廣東、廣西、四川等地，以及印度、非洲、巴基斯坦等國家。辣木籽富含蛋白質(zhì)、油脂、維生素等營養(yǎng)成分，同時含有黃酮、多酚、多糖等多種生物活性物質(zhì)，具有抗氧化、抗炎、降血糖血脂、治療糖尿病、護肝、抗癌等功能活性。辣木籽提取物是一種植物源天然抑菌劑，對念珠球菌、大腸桿菌、銅綠假單孢菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌等不同真菌和細菌有抑制作用，其抑菌成分被認為主要是酚類、黃酮類物質(zhì)。
蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus,B.cereus）是污染乳及乳制品主要的有害微生物之一，屬重點防控生物性危害因子，不僅會引起胃病、嘔吐、腹瀉，還能通過分泌蛋白酶降低乳制品的營養(yǎng)價值，縮短產(chǎn)品的貨架期。Zhao等從中國5個省份的500份乳制品樣品中分離出54株蠟樣芽孢桿菌，包括嬰幼兒配方奶粉（14%）、原料奶（26%）、巴氏殺菌奶（24%）、超高溫奶（16%）和奶酪（20%）。另外，巴氏殺菌對孢子的殺滅率低，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)蠟樣芽孢桿菌仍存在于市售巴氏乳中，其毒力基因?qū)θ梭w健康存在威脅。目前，加熱殺菌是保障乳品安全的主要技術手段，但過度加熱會破壞乳中熱敏性營養(yǎng)成分，因此在溫和殺菌方式下，利用天然抑菌成分延長乳品保質(zhì)期是乳品加工新技術的重點。已有研究表明，大蒜精油和乳酸鏈球菌素對乳中蠟樣芽孢桿菌有抑制作用，但天然抑菌劑應用于乳及乳制品中的具體抑菌效果仍需要進一步探究。
本研究以辣木籽為原料，采用超聲輔助提取法制備辣木籽提取物，以蠟樣芽孢桿菌為指示菌，通過響應面法，以抑菌圈大小為評判標準，評價辣木籽提取物的抑菌活性，明確溫度、pH值和紫外線照射對提取物抑菌穩(wěn)定性的影響，并研究辣木籽提取物在全脂乳和脫脂乳中的實際抑菌效果，以及對液態(tài)乳色度、風味、黏度的影響，為辣木籽提取物在液態(tài)乳中的應用提供理論依據(jù)。
1材料與方法
1.1材料與儀器
辣木籽購自云南帥潤科技有限公司；三株芽孢桿菌屬新型ST分離株蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus，B.cereus）ST-1351、ST-1350、ST-1349由乳品加工質(zhì)量安全工程技術實驗室分離自市售羊乳及其生產(chǎn)線；全脂乳粉、脫脂乳粉恒天然集團安佳；營養(yǎng)肉湯、瓊脂索萊寶試劑公司；無水乙醇、丙酮、石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯所有分離用的有機溶劑均為國產(chǎn)分析純。
DH-500電熱恒溫培養(yǎng)箱北京科偉永興儀器有限公司；SW-CJ-2D型雙人凈化工作臺蘇州凈化；立式壓力蒸汽滅菌鍋上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；DHP-140型干燥箱中儀國科科技有限公司；Ci7600色度儀愛色麗（上海）色彩科技有限公司；PEN3型電子鼻德國AIRSENSE；DHR-1型旋轉流變儀美國Waters公司。
1.2實驗方法
1.2.1菌懸液制備
將凍存在?80℃的蠟樣芽孢桿菌采用劃線法在營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基活化2次，挑單菌落接種于5 mL的營養(yǎng)肉湯中，37℃培養(yǎng)20 h，使細菌處于對數(shù)生長期。培養(yǎng)后的菌懸液經(jīng)離心（8500×g，10 min）去除上清液，使用生理鹽水洗滌菌體3次，隨后使用一定量的生理鹽水懸浮菌體沉淀，測定并調(diào)整菌懸液的OD600nm=0.5，使菌懸液濃度約為108CFU/mL。
1.2.2辣木籽提取物制備及單因素實驗
將辣木籽去殼粉碎過60目篩，準確稱取辣木籽粉末1.00 g，用冰乙酸和氨水調(diào)節(jié)pH至5，加入50 mL蒸餾水超聲15 min后，30℃條件下浸提2 h，在此基礎上設置單因素實驗，考察不同提取條件對辣木籽抑菌活性的影響，以抑菌圈為指標，分別考察提取溶劑（蒸餾水、無水乙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、石油醚）、pH（2、3、4、5、6、7）、料液比（1:10、1:30、1:50、1:70、1:90、1:110 g/mL）、浸提溫度（10、20、30、40、50、60℃）、浸提時間（0.5、1、1.5、2、2.5、3 h）5個因素對辣木籽抑菌活性成分制備的影響。提取液過濾后于40℃旋蒸至恒重，復溶并定容至濃度為0.1 g/mL。
1.2.3抑菌圈的測定
根據(jù)石超的方法稍作修改，量取15 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基至無菌培養(yǎng)皿中，冷卻凝固后備用。將制備好的菌懸液用生理鹽水稀釋至107CFU/mL，取100μL菌懸液均勻涂布至培養(yǎng)基上，將牛津杯（外徑8 mm、內(nèi)徑6 mm、高10 mm）至于培養(yǎng)基上，調(diào)整牛津杯位置并輕輕按壓，每個培養(yǎng)皿中均勻放置3只牛津杯。向牛津杯中加入經(jīng)0.22μm無菌濾器過濾后的100μL辣木籽提取物。以1 mg/mL青霉素G鈉為陽性對照，37℃培養(yǎng)20 h后，用游標卡尺測量抑菌圈大小。
1.2.4響應面試驗設計
根據(jù)單因素實驗結果，ST-1349菌株對辣木籽提取物抗性較強，為達到最好抑菌效果，故選取ST-1349菌株為試驗菌株，以蒸餾水為提取溶劑，對pH、料液比、浸提溫度、浸提時間四個主要影響因素設計響應面優(yōu)化試驗(表1)，以抑菌圈大小為響應值，利用Box-Behnken Design進行四因素三水平響應面設計，優(yōu)化辣木籽抑菌成分提取的工藝條件，從而得到最佳提取工藝。
表1響應面因素水平編碼表
1.2.5最小抑菌濃度和最小殺菌濃度的測定
最小抑菌濃度（Minimal Inhibitory Concentration，MIC）和最小殺菌濃度（Minimum Bactericidal Concentration，MBC）的測定參照Kang等的方法，將營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基冷卻至50℃左右后，加入24孔板，并添加辣木籽提取物使其濃度分別為10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078 mg/mL。接種2μL濃度為108CFU/mL的菌懸液于24孔板，以1 mg/mL的青霉素G鈉為陽性對照，將樣品于37℃培養(yǎng)，MIC和MBC分別為24 h和48 h后蠟樣芽胞桿菌不生長的辣木籽提取物濃度。
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