雞印第安納株沙門菌生長、致病性及藥物敏感性研究（三）
2.2細菌生長曲線測定
分離株在LB培養(yǎng)基中的生長曲線如圖3所示，SM24在培養(yǎng)2 h后即進入對數(shù)生長期，在3~6 h細菌增殖速度最快，從8 h開始生長逐漸減緩，進入穩(wěn)定期;培養(yǎng)12 h后菌液OD600值不再增加，活細菌含量緩慢下降，細菌生長進入衰退期。說明分離菌株SM24在LB培養(yǎng)基中生長良好，具有典型的細菌生長曲線。
圖3分離菌株SM24的菌液OD600值(A)和活細菌含量(B)生長曲線
2.3毒力測定
SM24分離株不同劑量對3日齡SPF雛雞進行攻毒，1.5×107 CFU攻毒組雛雞在5 d內(nèi)全部死亡，1.5×106 CFU組死亡5只，1.5×105 CFU組死亡2只，其他接種組無死亡，對照組雛雞狀態(tài)良好。表明分離株對雛雞具有致病性，經(jīng)Probit回歸計算SM24的LD50為8.50×105 CFU。
2.4耐藥性檢測
分離株SM24的藥物敏感性測定結(jié)果如表2所示，SM24對大觀霉素、阿米卡星、氯霉素、氟苯尼考、亞胺培南和多黏菌素B這6種抗生素敏感;對呋喃唑酮中介;對青霉素類(氨芐西林、阿莫西林)、頭孢菌素類(頭孢氨芐、頭孢噻肟、頭孢曲松)、喹諾酮類(恩諾沙星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星)、四環(huán)素類(多西環(huán)素、四環(huán)素)、磺胺類(復(fù)方新諾明、甲氧芐啶)以及新霉素、慶大霉素、阿奇霉素和氨曲南這16種抗生素表現(xiàn)耐藥。以上結(jié)果說明分離株SM24屬于多重耐藥性菌株，抗生素耐藥譜極廣。
表2分離菌株藥物敏感性檢測結(jié)果
2.5全基因組測序
對分離株SM24進行全基因組測序(見圖4、5)，獲得其全基因組大小為4 865 511 bp，GC含量為51.96%?；蚪M包含1個完整的細菌染色體序列和1個完整的質(zhì)粒序列，其中染色體序列大小為4 700 467 bp，質(zhì)粒大小為165 044 bp，質(zhì)粒命名為pASM-1。質(zhì)粒類型分析顯示，pASM-1為IncHI2質(zhì)粒，包含IncHI2和IncHI2A兩個復(fù)制子?；蚪M序列共有4 635個編碼蛋白的基因，含有108個非編碼RNA序列，包括86個tRNA、8個5S rRNA、7個16S rRNA和7個23S rRNA，并且存在2個CRISPR元件(CRISPR1和CRISPR2)和10個前噬菌體序列。
2.6全基因組序列分析
2.6.1血清型比對與數(shù)據(jù)庫注釋
全基因組測序數(shù)據(jù)通過SeqSero 1.2數(shù)據(jù)庫比對，顯示分離株SM24的O抗原為O4，H1抗原為z，H2抗原為1，7，血清型確定為印第安納沙門菌。對基因組序列進行數(shù)據(jù)庫比對注釋結(jié)果見表3，其中NR注釋的序列為4 460條、GO注釋的序列為2 762條、eggNOG注釋3 809條、KEGG注釋3 208條、Swiss注釋3 809條、CARD注釋144條、VFDB注釋280條。
圖4分離菌株SM24的基因組圈圖
圖5 pASM-1質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圈圖
表3基因功能注釋統(tǒng)計條
2.6.2整合接合元件(ICE)預(yù)測
通過ICEfinder預(yù)測，在分離株基因組中存在一個ICE，位置在染色體2 684 249~2 727 127，大小為42 879 bp，預(yù)測為整合移動元件(IME)，包含aatL和attR兩個整合位點。
2.6.3 GO數(shù)據(jù)庫注釋
SM24分離株基因組的GO注釋顯示，共有2 762個基因序列獲得注釋，占總編碼蛋白序列的59.59%。GO注釋的基因包含三大分類和38個二級分類(圖6)，其中大類包括生物過程(biologicalprocess)、細胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function)，二級分類包括代謝過程(metabolic process)、生物黏附(biological adhesion)、胞內(nèi)成分(intracelluar)、蛋白復(fù)合物(protien-con?taining complex)、催化活性(catalytic activity)、轉(zhuǎn)運活性(transporter activity)等生命過程。
圖6 SM24基因組序列GO功能分類圖
2.6.4毒力基因分析
通過VFDB數(shù)據(jù)庫比對分析，發(fā)現(xiàn)菌株SM24共注釋到280個毒力基因，編碼的產(chǎn)物主要參與分泌系統(tǒng)、菌毛黏附、鐵攝取、免疫逃避等(圖7)。其中與細菌分泌系統(tǒng)相關(guān)的注釋基因共79條，占28.21%，主要包括毒力島1(SPI1)和毒力島2(SPI2)基因編碼的Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)以及由Hcp分泌島1(HSI-I)和沙門菌中心島(SCI)基因編碼的Ⅵ型分泌系統(tǒng)(T6SS);與細菌黏附有關(guān)的菌毛黏附?jīng)Q定因素和運動性侵襲黏附相關(guān)毒力基因分別注釋61條和46條，共占38.21%;鐵攝取相關(guān)毒力基因注釋了22條，其中包含典型的沙門菌素合成與轉(zhuǎn)運基因(iroBCDEN)、腸桿菌素的合成(entABC?DEF)和轉(zhuǎn)運(fepBCDG)相關(guān)毒力基因;編碼脂多糖(lpxAC、gtrAB等)和莢膜等與免疫逃避的毒力基因有17條。除此之外，還有與細菌入侵(invAC、orgAB等)、黏附(fimACDFH)、營養(yǎng)因子(allAB?CDRS)等多種毒力相關(guān)基因。
圖7 SM24分離株毒力基因統(tǒng)計
2.6.5耐藥基因分析
通過CARD數(shù)據(jù)庫比對，SM24株基因組序列中共辨別出144條耐藥基因，其中133條位于細菌染色體上，11條位于pASM-1質(zhì)粒上。所有耐藥基因中，與多重耐藥相關(guān)的基因為93條，占64.58%。對耐藥機制分類發(fā)現(xiàn)，與抗生素外排泵相關(guān)基因有62條，與抗生素靶點改變的基因有53條，除此之外還有與抗生素失活(14條)、抗生素滲透性降低(9條)、抗生素靶點保護和替代(各2條)等相關(guān)的耐藥基因(圖8)。IME和質(zhì)粒等均屬于細菌基因組可移動元件，常攜帶耐藥基因，導(dǎo)致耐藥性的快速傳遞。對SM24染色體上IME位點和pASM-1質(zhì)粒上攜帶的耐藥基因統(tǒng)計結(jié)果見表4。
染色體IME位點存在一個OmpK37耐藥基因，其與耐頭孢菌素類抗生素等多重耐藥性有關(guān);pASM-1質(zhì)粒結(jié)構(gòu)上攜帶與耐受四環(huán)素類(tetA、tetR)、磺胺類(sul1)、利福平類(arr-3)、氯霉素類(catB3)、頭孢菌素類(OXA-1)、喹諾酮類(aac(6′)-Ib-cr)、氨基糖苷類(aac(3′)-Iid、aph(3)-Ia)、大環(huán)內(nèi)酯類(mphA)和磷霉素類(FosA3)藥物相關(guān)的基因。
圖8 SM24分離株不同耐藥機制耐藥基因統(tǒng)計
表4 SM24染色體IME和pASM-1質(zhì)粒攜帶的耐藥基因
2.7比較基因組分析
菌株SM24和國內(nèi)分離的6株雞源印第安納沙門菌參考基因組的共有和特有基因分析結(jié)果見圖9A，7個菌株共有基因有3 856條，分離株SM24的特有基因最多為365條，廣州分離株FJC33(CP041699.1)的特有基因有68條，江蘇分離株YZ21MCS4(CP089313.1)和XZ14C1328(CP102827.1)分別擁有32和18條特有基因，四川分離株JT01(CP028131.1)和北京分離株D90(CP022450.1)均有1條特有基因，上海分離株SJTUF13520v2(CP041181.1)未見特有基因。菌株進化樹構(gòu)建結(jié)果顯示(圖9B)，SM24菌株與國內(nèi)其他地區(qū)分離的雞源印第安納沙門菌分離株不在同一進化分支，說明其與國內(nèi)分離的6個參考菌株的遺傳進化距離較遠。注:?本研究分離菌株。
圖9分離株SM24與參考菌株的共有和特有基因分析(A)和基因組進化樹構(gòu)建(B)
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