鵪鶉肺炎克雷伯菌血清型鑒定、耐藥性檢測及致病潛力（四）
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肺炎克雷伯菌是一種重要的機會致病菌，常見于家禽、牲畜等動物體內(nèi)。在禽類感染中，肺炎克雷伯菌可引起禽類腹瀉、腸道炎癥、出血等癥狀。本研究從腹瀉鵪鶉糞便中分離出2株肺炎克雷伯菌Ksp-A1和Ksp-A2.通過形態(tài)學(xué)觀察、生化鑒定、16SrDNA測序和系統(tǒng)進化樹構(gòu)建，確認2株分離株均為肺炎克雷伯菌，其生化特性均符合肺炎克雷伯菌的典型特征，這為進一步的分子生物學(xué)和耐藥性研究提供了基礎(chǔ)。表6各組小鼠死亡率統(tǒng)計結(jié)果近年來，由于規(guī)模化養(yǎng)殖場大量使用抗生素，耐藥性問題逐漸成為一個必須攻破的難題。肺炎克雷伯菌能通過生成水解酶來抵御抗生素，這使得常見抗菌藥物對肺炎克雷伯菌所致疾病的治療難度加大。
本試驗中所分離的Ksp-A1菌株攜帶blaSHV、aacC2、oqxAB、tetA、tetM和cat1共6種耐藥基因，Ksp-A2菌株攜帶blaSHV、aaaA1、aacC2、oqxAB、qnrA、tetA、tetM和cat1共8種耐藥基因，Ksp-A1和Ksp-A2均攜帶有blaSHV、aacC2、oqxAB、tetA、tetM和cat16種耐藥基因，其中blaSHV基因編碼一種β-內(nèi)酰胺酶，該酶能水解包括青霉素類和頭孢菌素類在內(nèi)的多種β-內(nèi)酰胺類抗菌藥。oqxAB基因編碼的OqxAB蛋白是一種多重耐藥外排泵，其對氟喹諾酮類、喹噁啉類、氨基糖苷類和氯霉素類等多種抗菌藥以及部分消毒劑類物質(zhì)具有外排作用。這種耐藥性的存在減少了藥物在細菌細胞內(nèi)的累積濃度，從而降低了藥物的有效性。
tetA基因編碼四環(huán)素抗性蛋白tetA,該蛋白屬于主要促進因子（MFS）家族，它是一種外排泵，能利用細胞膜上的質(zhì)子梯度作為能量來源來驅(qū)動抗生素的外排，可以將四環(huán)素類抗菌藥從細菌細胞內(nèi)部運輸?shù)酵獠凯h(huán)境中，從而減少細胞內(nèi)藥物的積累，使細菌對四環(huán)素類抗菌藥產(chǎn)生耐藥性。tetM基因編碼的蛋白是一種核糖體保護蛋白，它能賦予細菌對四環(huán)素類抗菌藥的耐藥性，這種耐藥性主要是通過保護細菌的核糖體免受四環(huán)素類藥物的抑制作用來實現(xiàn)的，從而允許細菌在存在這些抗菌藥物的環(huán)境中生長。cat1基因編碼過氧化氫酶蛋白，其能夠催化過氧化氫的分解，在控制體內(nèi)活性氧平衡中起重要作用。
此外，分離株Ksp-A2獨有的2種基因分別為aaaA1和qnrA,aaaA1基因是肺炎克雷伯菌中與耐藥性相關(guān)的一個重要基因，是AcrAB-TolC外排泵系統(tǒng)的一部分。外排泵是細菌細胞膜上的蛋白質(zhì)復(fù)合體，能夠?qū)⑦M入細胞的抗生素泵出細胞外，從而減少藥物在細胞內(nèi)的積累，使細菌產(chǎn)生耐藥性，包括但不限于四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、β-內(nèi)酰胺類、氟喹諾酮類等。qnrA基因編碼蛋白QnrA屬于五肽重復(fù)家族一員，能夠保護細菌的DNA旋轉(zhuǎn)酶和拓撲異構(gòu)酶Ⅳ免受喹諾酮類抗菌藥的抑制作用。肺炎克雷伯菌侵襲宿主機體的條件與其自身莢膜多糖、菌毛、分泌的毒素等有關(guān)。
本試驗對分離株進行血清型和毒力基因檢測，結(jié)果顯示，分離株Ksp-A1和Ksp-A2莢膜血清型均為K57,Hsu等研究報道，K57是與肺炎克雷伯菌相關(guān)的肺炎相關(guān)綜合征（PLA）莢膜類型之一，這表明本研究分離株可能具有與PLA相關(guān)的臨床特征。其中Ksp-A1菌株攜帶K88、hlyE、iucD、irp2、ompA和ompC6種毒力基因，Ksp-A2攜帶K88、hlyE、iucD、irp2、ompA、ompC和malX7種毒力基因。這些毒力基因在肺炎克雷伯菌和大腸桿菌致病機制中扮演著相似的角色。K88毒力基因編碼K88菌毛，其賦予細菌定植能力并促進細菌黏附于宿主腸道上皮細胞，抵抗宿主的自然清除機制，并助其逃避免疫系統(tǒng)，引發(fā)腸道感染。hlyE基因編碼的溶血素E（HlyE）能夠形成跨膜孔洞，導(dǎo)致紅細胞溶解。iucD基因編碼蛋白參與氣桿菌素生物合成途徑，氣桿菌素是一種鐵載體，可以幫助細菌從宿主中獲取必需的鐵元素。
iucD基因高表達的細菌在與宿主細胞的競爭中具有優(yōu)勢，能夠使致病菌更有效地獲取鐵元素，從而增強其自身致病性。irp2基因編碼鐵調(diào)節(jié)蛋白2（IRP2），它參與調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的鐵代謝，IRP2通過結(jié)合鐵反應(yīng)元件IREs來控制鐵代謝相關(guān)基因的表達。當(dāng)iucD和irp2基因共同作用時可能產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，進一步增強肺炎克雷伯菌的致病性，iucD基因能幫助細菌獲取鐵元素，而irp2基因則能幫助細菌調(diào)節(jié)和利用這些鐵元素，以支持其生長和毒性因子的產(chǎn)生。在肺炎克雷伯菌中，ompA和ompC基因編碼的孔蛋白（Porins）是細菌外膜中的重要成分，在細菌的致病機制和耐藥性中起著關(guān)鍵作用。ompA基因編碼的OmpA蛋白是一種常見的外膜蛋白，它參與形成細菌外膜的孔道，控制分子進出。OmpA在細菌的黏附、侵襲宿主細胞以及調(diào)節(jié)細菌表面特性中發(fā)揮作用，這些特性對于肺炎克雷伯菌的致病性至關(guān)重要。
ompC基因編碼的OmpC蛋白在調(diào)節(jié)細菌對外界環(huán)境的適應(yīng)性和抗生素的通透性方面發(fā)揮作用。OmpC的存在可以控制抗菌藥進入細菌細胞的量，從而影響細菌對某些抗菌藥物的敏感性。分離株Ksp-A2還攜帶有malX基因，其功能尚未被充分研究，但有研究表明它可能與細菌的生物膜形成相關(guān)。本研究對分離的2株肺炎克雷伯菌進行生長特性分析，結(jié)果顯示，分離株Ksp-A1和Ksp-A2均在培養(yǎng)2h后進入對數(shù)生長期，其中Ksp-A1在12h達到生長峰值，Ksp-A2在培養(yǎng)9h后到達生長峰值，這與Li等報道的在合適培養(yǎng)條件下，肺炎克雷伯菌生長速率和生長曲線表現(xiàn)出明顯階段性變化的結(jié)果相一致。酸堿耐受性試驗結(jié)果顯示，分離株Ksp-A1和Ksp-A2在pH4.0-9.0范圍內(nèi)生長較好，且pH7.0條件培養(yǎng)時生長狀態(tài)最佳，這表明2株分離株均能適應(yīng)中性環(huán)境，具備較強的生存能力，與Cheng等發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯菌中性pH條件下生長最佳的結(jié)果相符。
此外，分離株Ksp-A1和Ksp-A2的最佳接種量分別為3%和2%,顯示出不同菌株在接種量上的適應(yīng)性差異，這為后續(xù)的菌株應(yīng)用研究提供了參考。本研究通過動物試驗評估了分離株Ksp-A1和Ksp-A2的致病性，結(jié)果顯示，試驗組小鼠在注射后12h內(nèi)出現(xiàn)明顯的發(fā)病癥狀，包括被毛粗亂、精神沉郁、呼吸困難和腹瀉，對照組小鼠活動正常，表明分離株Ksp-A1和Ksp-A2具有強致病性。這與Weber-Dabrowska等高感染劑量情況下肺炎克雷伯菌能夠在小鼠體內(nèi)迅速引發(fā)病癥的研究結(jié)果一致。隨著菌液濃度增加，Ksp-A1和Ksp-A2的致死率呈現(xiàn)明顯上升趨勢，且分離株Ksp-A2的致死性明顯高于Ksp-A1,可能與其攜帶的malX毒力基因相關(guān)，這也表明毒力基因種類和數(shù)量與肺炎克雷伯菌致病性密切相關(guān)，攜帶特定毒力基因的菌株通常表現(xiàn)出更強致病能力和生存優(yōu)勢，尤其在宿主免疫系統(tǒng)壓力下。
綜上所述，本研究結(jié)果與國內(nèi)外相關(guān)研究相符，表明不同來源肺炎克雷伯菌在致病性和毒力基因組成上存在明顯差異，強調(diào)了肺炎克雷伯菌的高毒力潛力和其攜帶的多種毒力基因在致病過程中的重要性。試驗結(jié)果不僅為研究肺炎克雷伯菌的致病機制提供依據(jù)，也為未來的疫苗開發(fā)和治療策略制定提供重要的參考信息，后續(xù)可進一步探索相關(guān)毒力基因的功能及其在肺炎克雷伯菌感染中的具體作用，以及開發(fā)針對性的防治措施。
4結(jié)論
本研究從腹瀉鵪鶉糞便中分離出2株肺炎克雷伯菌Ksp-A1和Ksp-A2,2株分離株均為K57血清型，表現(xiàn)出多重耐藥性，攜帶blaSHV、aacC2、oqxAB、tetA、tetM和cat1等耐藥基因，以及K88、hlyE、iucD、irp2、ompA和ompC等毒力基因，對小鼠具有致病性，且其攜帶的毒力基因與致病性密切相關(guān)。
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