25種天然植物精油對藍(lán)莓致病菌生長曲線、抑制作用（二）
1材料與方法
1.1材料與試劑
藍(lán)莓果實(shí)為脆甜花香25號，采自云南省玉溪市，藍(lán)莓冷鏈運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室后篩選出大小、硬度均一，表面無機(jī)械擦傷，無病蟲害的果實(shí)置于4℃?zhèn)溆谩?
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1.2儀器與設(shè)備
微生物生長曲線監(jiān)測系統(tǒng)，丹麥Biosense公司；Universal Hood II凝膠成像儀美國Bio-Rad公司；TGreat型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀天根生化科技（北京）有限公司；SCW-CJ-1F垂直流潔凈工作臺蘇州安瑞凈化科技有限公司。
1.3方法
1.3.1藍(lán)莓致病菌的收集以及菌種純化
將采購的盒裝藍(lán)莓果實(shí)放置于溫度25℃、相對濕度95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至病害發(fā)生。沿用傳統(tǒng)的組織切割法，將不同發(fā)病癥狀的果實(shí)分開放置，取發(fā)病部位組織（病健交界處，長×寬＝3 mm×3 mm）于無菌水中清洗，之后置于體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液中浸泡30 s，取出后用無菌水清洗3遍，將組織貼于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基培養(yǎng)，每種形態(tài)接種3個(gè)培養(yǎng)皿，在28℃、相對濕度95%條件下培養(yǎng)3～5 d，每天觀察平板，及時(shí)將新長的菌（邊緣處挑取少量菌絲）轉(zhuǎn)接到新的PDA培養(yǎng)基直至其菌落形態(tài)一致、無雜菌，即獲得純化的致病菌。藍(lán)莓致病菌在不同時(shí)間點(diǎn)共分離3次。對純化的致病菌進(jìn)行編號，挑取少許菌種到2 mL無菌離心管中-80℃保存。
1.3.2病原菌菌落形態(tài)學(xué)觀察鑒定
將純化后的菌株接種至PDA培養(yǎng)基中，在28℃、相對濕度95%條件下培養(yǎng)5 d，利用光學(xué)顯微鏡觀察其菌絲和孢子的形態(tài)，結(jié)合真菌鑒定手冊進(jìn)行初級鑒定。
1.3.3病原菌致病性測定
選取健康無傷、大小均一的藍(lán)莓果實(shí)，用體積分?jǐn)?shù)2%的次氯酸鈉溶液清洗晾干后，在藍(lán)莓赤道部位劃3 mm×3 mm的傷口，將10μL 1×106 CFU/mL的孢子懸浮液注入每顆藍(lán)莓傷口，晾干后于25℃、相對濕度95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并持續(xù)觀察其發(fā)病情況。每種菌接種10顆藍(lán)莓，重復(fù)3次，根據(jù)科赫法則（接種后的發(fā)病癥狀是否與分離前一致，病斑擴(kuò)散情況以及發(fā)病率）判定該菌株是否為藍(lán)莓采后致病菌。以未接種病原菌的藍(lán)莓為對照組。
1.3.4菌落分子生物學(xué)鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建
刮取適量孢子至馬鈴薯葡萄糖肉湯（potato dextrose broth，PDB）培養(yǎng)液中，在28℃、180 r/min搖床培養(yǎng)2 d，過濾菌絲，用0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）沖洗3次后，利用十六烷基三甲基溴化銨法提取各純化菌株的DNA，用3種真菌通用引物ITS（600 bp，ITS1/ITS4）、BenA（511 bp，Bt2a/Bt2b）和CaM（580 bp，CMD5/CMD6）分別對病原菌的基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫上已知序列進(jìn)行BLAST同源比對，選取同源性較高的基因進(jìn)行DNAMAN序列比對，再采用MEGA 11.0軟件通過Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。
1.3.5病原菌最適溫度測定
將病原菌菌餅接入PDA培養(yǎng)基，分別放入4、15、20、25、28、30、35℃培養(yǎng)箱進(jìn)行為期3 d的培養(yǎng)，結(jié)束后測量其菌斑直徑。每個(gè)溫度梯度做3次重復(fù)。
1.3.6病原菌生長曲線測定
將一定量的孢子懸浮液（病原菌I和病原菌II）加入適量PDB培養(yǎng)液中，使其終濃度為1×105 CFU/mL，在搖床中培養(yǎng)72 h，每隔6 h取樣烘干至質(zhì)量恒定后進(jìn)行測量，每組重復(fù)3次。由于病原菌III產(chǎn)孢量少，根據(jù)李鵬等的方法，取PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d的病原菌III，用6 mm的打孔器在菌斑最外圍打菌餅并將其添加到PDB培養(yǎng)液中培養(yǎng)72 h，每隔6 h取樣烘干至質(zhì)量恒定后進(jìn)行測量，每組3次重復(fù)。
1.3.7病原菌孢子萌發(fā)率測定
將病原菌分生孢子菌懸液注入到PDB中，確保其終濃度為1×106 CFU/mL（病原菌I和病原菌II）或1×105 CFU/mL（病原菌III），放入搖床中培養(yǎng)，分別在0、3、6、9、12、15、18、21、24 h時(shí)取出，參考李翀的孢子萌發(fā)率測定方法并稍作修改。病原菌I、II每組計(jì)數(shù)100個(gè)孢子，病原菌III每組計(jì)數(shù)50個(gè)孢子，以牙管長度超過其孢子半徑判斷為萌發(fā)，統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)的情況，每種菌進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。按式（1）計(jì)算孢子萌發(fā)率：
孢子萌發(fā)率=孢子萌發(fā)數(shù)/孢子總數(shù)*100%
1.3.8 96孔板法初篩抑菌精油
參考孫暢等的96孔板抑菌法并稍作修改。參考各種精油的抑菌濃度以及前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，以100μL PDB為底液，加入等體積1×106 CFU/mL的病原菌孢子懸浮液，再加入適量精油使其濃度分別為0、1.00、1.25、1.50、2.00μL/mL，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，空白對照為加入無菌的PDB培養(yǎng)基，陰性對照分別為加入孢子懸浮液的PDB培養(yǎng)基和加入孢子懸液、吐溫80的PDB培養(yǎng)基。25℃培養(yǎng)2 d，在顯微鏡下觀察菌的生長情況，統(tǒng)計(jì)致病菌在不同濃度精油培養(yǎng)基的生長情況（有無菌絲生長）。
1.3.9培養(yǎng)皿法篩選精油有效抑菌濃度
根據(jù)96孔板法初篩的精油濃度，再結(jié)合二倍稀釋法細(xì)篩其最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）和最低殺菌濃度（minimal fungicidal concentration，MFC）。將適量精油加入至含有0.50%（V/V）吐溫80的無菌PDA培養(yǎng)基中，確保終濃度分別為0、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00μL/mL，倒入培養(yǎng)皿（直徑90 mm，容積110 mL），等待冷卻凝固。取新培養(yǎng)的菌餅（6 mm）接種至PDA培養(yǎng)基上，每個(gè)濃度做3～4個(gè)重復(fù)，放入適宜的培養(yǎng)箱（病原菌I、III、IV：25℃；病原菌II：28℃）中培養(yǎng)4 d左右，期間采用十字交叉法測量菌斑直徑并按式（2）計(jì)算抑菌率。48 h內(nèi)使菌餅無生長變化的精油濃度為MIC，96 h內(nèi)使菌餅無生長變化的精油濃度為MFC。
式中：de為實(shí)驗(yàn)組病斑直徑/mm；dc為對照組病斑直徑/mm。
1.3.10 5種植物精油的抑菌作用測定
根據(jù)1.3.3節(jié)的方法清理藍(lán)莓果實(shí)并進(jìn)行致病菌接種，將藍(lán)莓果實(shí)隨機(jī)分成6組，每組30顆藍(lán)莓，接種10μL皮落青霉孢子懸浮液（1×106 CFU/mL），每組重復(fù)3次。將滴加精油的脫脂棉粘在盛放藍(lán)莓的透明塑料盒（盒內(nèi)總體積320 mL）的盒蓋上（濃度為1 MFC），于溫度為25℃、相對濕度為95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d，觀察并記錄果實(shí)發(fā)病情況。
1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析
藍(lán)莓、孢子和菌絲樣本的分配遵循完全隨機(jī)的原則。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次后，使用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，圖表使用Origin 2021軟件繪制。數(shù)據(jù)結(jié)果以表示。P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
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