傳統(tǒng)腌干魚(yú)制品中降解生物胺菌株的篩選、生長(zhǎng)曲線及影響因素（二）
1.2.4不同培養(yǎng)條件對(duì)菌株降解生物胺的影響
1.2.4.1溫度對(duì)菌株降解生物胺的影響
將菌活化后，以2%的接種量接入(pH5.5、食鹽濃度和生物胺底物濃度均為0、含四種生物胺)MRS肉湯培養(yǎng)基中，分別置于溫度(20、25、30、35、40、45℃)條件下培養(yǎng)24h。
1.2.4.2初始pH對(duì)菌株降解生物胺的影響
將菌活化后，以2%的接種量接入(初始pH(4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)、食鹽濃度和生物胺底物濃度均為0、含四種生物胺)MRS肉湯培養(yǎng)基中，置于30℃條件下培養(yǎng)24h。
1.2.4.3食鹽濃度對(duì)菌株降解生物胺的影響
將菌活化后，以2%的接種量接入(食鹽濃度(0、40、80、120、160g/L)、pH5.5、生物胺底物濃度為0含四種生物胺)MRS肉湯培養(yǎng)基中，置于30℃條件下培養(yǎng)24h。
1.2.4.4生物胺底物濃度對(duì)菌株降解生物胺的影響
將菌活化后，以2%的接種量接入(生物胺底物濃度(25、50、100、200、300mg/L)、pH5.5、食鹽濃度為0、含四種生物胺)MRS肉湯培養(yǎng)基中，置于30℃條件下培養(yǎng)24h。分別取樣，檢測(cè)培養(yǎng)基中生物胺含量，以未接種的培養(yǎng)基作空白對(duì)照。
1.2.5菌株間的拮抗性實(shí)驗(yàn)
用接種環(huán)挑取活化后的乳酸菌，在一定條件下培養(yǎng)至同一稀釋(108CFU/mL)的不同菌懸液，在MRS平板上作相互垂直劃線接種，于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，觀察。如兩垂直線交界處無(wú)菌生長(zhǎng)，則說(shuō)明這兩菌株之間有拮抗性，即為陽(yáng)性，否則為陰性。
1.2.6降解生物胺菌在咸魚(yú)加工中的應(yīng)用及效果測(cè)定
在傳統(tǒng)法咸魚(yú)的加工工藝基礎(chǔ)上，加入具有生物胺降解能力的乳酸菌，制作5種不同類型的咸魚(yú):CK組為空白組;A組添加鼠李糖乳酸菌(Lr);B組添加植物乳桿菌(Lp);C組添加鼠李糖乳酸菌和植物乳桿菌混合菌液(Lr∶Lp=1∶2);D組添加鼠李糖乳酸菌和植物乳桿菌混合菌液(Lr∶Lp=2∶1)。發(fā)酵劑接種量為108CFU/mL。分別檢測(cè)制作的5種咸魚(yú)的8種生物胺含量。
1.2.7生物胺含量測(cè)定
參照參考文獻(xiàn)中的Dns-Cl-柱前衍生HPLC-FLD法測(cè)定生物胺含量。
1.2.8數(shù)據(jù)處理
采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及作圖，所有樣品均作三次平行;另外顯著性分析采用JMP軟件中的Tukey法進(jìn)行兩兩比較，以p<0.05說(shuō)明變化顯著。
2結(jié)果與分析
2.1降解生物胺菌株的篩選
通過(guò)對(duì)傳統(tǒng)加工咸魚(yú)中菌株的分離純化，獲得58株乳酸菌疑似菌株，對(duì)其進(jìn)行單一菌種發(fā)酵后，Dns-Cl-柱前衍生HPLC-FLD法測(cè)定生物胺降解量。結(jié)果分離到3株具有生物胺降解能力的菌株，分別編號(hào)為MRS1、MRS2、MRS3。菌株鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。其中MRS1經(jīng)鑒定是鼠李糖乳桿菌(Lr)，對(duì)腐胺的降解率為30.88%、對(duì)組胺的降解率為38.56%、對(duì)酪胺的降解率為32.63%;而MRS2為植物乳桿菌(Lp)，其對(duì)腐胺的降解率為31.29%、對(duì)組胺的降解率為26.93%、對(duì)尸胺的降解率為35.56%;MRS3為戊糖片球菌(Pp)，其對(duì)腐胺的降解率最大，達(dá)到35.23%、對(duì)酪胺的降解率為26.19%，對(duì)組胺為20.56%;說(shuō)明乳酸菌中確實(shí)存在能降解生物胺的菌株，這與Almudena García-Ruiz的研究結(jié)果相一致，但分離到的菌株其降解腐胺、組胺和酪胺的能力均比Almudena García-Ruiz的從酒中分離到的乳酸菌株高。
2.2菌株生長(zhǎng)曲線測(cè)定
由圖1可知，在前18 h，Lp的生長(zhǎng)速度略高于Lr和Pp，并且Lr和Pp的生長(zhǎng)曲線保持高度一致，在18 h后才出現(xiàn)差異。18 h后Lr的生長(zhǎng)速度要明顯高于Lp和Pp，其生長(zhǎng)曲線隨著時(shí)間的增加與其他2個(gè)菌株的差異逐漸增大。生長(zhǎng)曲線的測(cè)定有利于觀察菌株在生長(zhǎng)過(guò)程中菌體密度的變化，進(jìn)而掌握菌體的活力變化，以確定菌體的最佳收獲時(shí)間。菌體活力強(qiáng)，單位體積菌數(shù)多的培養(yǎng)時(shí)間為收獲的最佳時(shí)間，也就是對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期穩(wěn)定生長(zhǎng)前期。由圖1可以看出，3個(gè)菌株的菌體密度隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增大，在培養(yǎng)6 h左右，到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)24 h后對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期結(jié)束達(dá)到穩(wěn)定生長(zhǎng)期，可見(jiàn)，此時(shí)是菌體收獲的最佳時(shí)期。當(dāng)菌株培養(yǎng)到30 h后，開(kāi)始出現(xiàn)下降趨勢(shì)，這是由于培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡或者菌株自身產(chǎn)生某些代謝毒素。
圖1菌株的生長(zhǎng)曲線
2.3菌株對(duì)混合生物胺的降解動(dòng)力學(xué)分析
從圖2可以看出，分離到的三種菌均能夠同時(shí)降解腐胺、尸胺、組胺和酪胺，在24 h內(nèi)，菌對(duì)肉湯培養(yǎng)基中生物胺的降解率逐漸升高，并在24 h達(dá)到最大降解量，此后基本持平或略有下降。其中，菌株Lr對(duì)組胺和尸胺有較強(qiáng)的降解能力，最高分別可達(dá)37.87%和37.11%;菌株Lp對(duì)腐胺和尸胺有較強(qiáng)的降解能力，最高分別可達(dá)32.39%和36.39%;菌株P(guān)p也表現(xiàn)出較強(qiáng)的腐胺和尸胺降解能力，最高分達(dá)36.92%和27.89%。由此可知，Lr、Lp和Pp在發(fā)酵食品中具有一定的應(yīng)用潛力。由圖1和圖2可得出結(jié)論:24 h為菌體最佳收獲時(shí)期同時(shí)也是菌體降解生物胺的最佳時(shí)期，如果發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，菌體或多或少會(huì)產(chǎn)生一些有毒的代謝產(chǎn)物，這將影響魚(yú)肉的品質(zhì)安全性，所以合適的菌株發(fā)酵時(shí)間非常重要。
圖2三種菌對(duì)混合生物胺的降解動(dòng)力學(xué)
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