泥蚶致病性哈維氏弧菌的分離與鑒定、藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果
弧菌是海洋環(huán)境中常見(jiàn)的細(xì)菌種群之一，廣泛分布于河口、海灣、近岸海域的海水和海洋動(dòng)物體內(nèi)。弧菌屬種類繁多，主要致病弧菌有哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)、鰻弧菌(V.anguillarum)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、霍亂弧菌(V.cholerae)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)等。哈維氏弧菌是海水養(yǎng)殖業(yè)重要的條件致病菌，已有研究表明，哈維氏弧菌可感染褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)、尖吻鱸(Latescalcarifer)、刺尾魚(yú)(Acanthurussohal)、紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)、斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeusmonodon)、凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)和文蛤(Meretrixmeretrix)等重要水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物，并致其死亡，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
泥蚶(Tegillarcagranosa)屬瓣鰓綱、列齒目、蚶科、泥蚶屬，是我國(guó)沿海灘涂的主要養(yǎng)殖貝類之一，也是沿海居民青睞的生食雙殼貝類之一。隨著泥蚶養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，在每年溫度上升的4—5月和繁殖后的7—8月間，易發(fā)生泥蚶細(xì)菌性疾病，嚴(yán)重影響了泥蚶養(yǎng)殖效益和泥蚶養(yǎng)殖業(yè)。研究發(fā)現(xiàn)，夏季泥蚶體內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌群主要是弧菌屬細(xì)菌和氣單胞菌屬細(xì)菌；對(duì)浙江省11市泥蚶副溶血弧菌污染情況檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，50%為陽(yáng)性。尚未見(jiàn)有關(guān)哈維氏弧菌感染泥蚶的報(bào)道，僅見(jiàn)泥蚶血紅蛋白(Tg-HbⅡ)酶解多肽對(duì)哈維氏弧菌具有明顯的抗菌活性的研究。2014年8月，浙江灘涂養(yǎng)殖泥蚶暴發(fā)大規(guī)模死亡，其主要特征為閉殼肌無(wú)力，軟體部顏色發(fā)白，體液呈淡紅色或無(wú)色，黏液增多。筆者自瀕死的泥蚶中分離得到1株優(yōu)勢(shì)菌，從該菌株的形態(tài)、生理生化特征、分子生物學(xué)分類方面進(jìn)行研究，以期為泥蚶病害研究提供生物學(xué)資料，為泥蚶弧菌病的防治提供科學(xué)依據(jù)。
菌株J14的分離與鑒定
哈維氏弧菌為條件致病菌，有毒株可引起養(yǎng)殖貝類發(fā)病、死亡。如感染哈維氏弧菌的文蛤，在發(fā)病高峰期病狀特征明顯，解剖患病文蛤發(fā)現(xiàn)，其外套膜萎縮，閉殼肌松弛、開(kāi)合無(wú)力、兩殼呈張開(kāi)狀態(tài)，軟體部消瘦，部分發(fā)病文蛤的鰓黏液明顯增多。本試驗(yàn)中，菌株J14是從夏季規(guī)模性死亡的泥蚶中分離得到的，表明菌株J14可在高溫環(huán)境下生長(zhǎng)。由人工感染試驗(yàn)結(jié)果可知，感染后的泥蚶出現(xiàn)明顯的病癥：外套膜萎縮，閉殼肌松弛，開(kāi)合無(wú)力，軟體部消瘦，有些發(fā)爛發(fā)白，肝胰腺顏色淡紅，體液淡紅至無(wú)色，部分患病泥蚶鰓黏液明顯增多，黏液呈煙灰色。感染后死亡率高達(dá)90%。人工感染發(fā)病泥蚶的癥狀與自然發(fā)病的泥蚶癥狀表現(xiàn)一致，說(shuō)明菌株J14具備重復(fù)感染的能力。泥蚶貝殼堅(jiān)硬，如受到外界刺激，則雙殼緊閉，較難通過(guò)注射方法將菌液注射到泥蚶軟體部，因此本試驗(yàn)中采用不同密度的J14菌液浸泡感染泥蚶，分析得到菌株J14感染泥蚶的96 h半致死密度為7.74×106個(gè)/mL，表明菌株J14具有較強(qiáng)致病性。
對(duì)菌株J14和J19進(jìn)行形態(tài)、常規(guī)生理生化鑒定，結(jié)果顯示，2個(gè)菌株均為革蘭氏陰性細(xì)菌，硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基平板上呈黃色，生理生化鑒定結(jié)果與哈維氏弧菌特征極為相近。與標(biāo)準(zhǔn)菌株比較，部分鑒定項(xiàng)存在差異，推測(cè)2個(gè)菌株可能為哈維氏弧菌。對(duì)菌株J14和J19進(jìn)行16S rRNA基因分子生物學(xué)鑒定，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示，2株菌與哈維氏弧菌聚為一支。綜合生理生化與分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，確定這2個(gè)菌株均為哈維氏弧菌。
哈維氏弧菌J14的毒力基因
已有研究表明，弧菌屬不同種間存在相同的毒力基因，相同的種內(nèi)存在不同的毒力基因，毒力基因或相關(guān)毒力因子的轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致某些無(wú)毒株變?yōu)橛卸局暌约俺霈F(xiàn)弧菌新病原的重要原因。本試驗(yàn)中，共檢測(cè)了14種毒力基因的攜帶情況，結(jié)果顯示，哈維氏弧菌J14和J19均攜帶有群體效應(yīng)調(diào)控基因luxR，毒力調(diào)控基因toxR，溶血素基因vhhA、vhhB，毒力相關(guān)基因toxS，幾丁質(zhì)酶基因chiA，絲氨酸蛋白酶基因。Xu等對(duì)46株不同哈維氏弧菌的17種毒力基因進(jìn)行PCR分析，發(fā)現(xiàn)所有的致病菌均含有l(wèi)uxR、toxRVh、vhh、chiA、絲氨酸蛋白酶基因這5種毒力基因，表明哈維氏弧菌毒力是由多基因共同作用的結(jié)果。據(jù)Nakamura等報(bào)道，毒力基因在適應(yīng)不同環(huán)境和不同宿主方面具有優(yōu)勢(shì)，擁有很強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力。另外，哈維氏弧菌致病菌株較非致病菌株可能擁有更強(qiáng)的接收通過(guò)基因水平轉(zhuǎn)移而來(lái)的外源基因的能力。本試驗(yàn)中的鞭毛結(jié)構(gòu)基因flaA在2個(gè)菌株中存在差異，J14不含有flaA基因，而J19含有flaA基因，由此推測(cè)，毒力基因水平轉(zhuǎn)移可能是2株菌攜帶毒力基因差異的原因。
哈維氏弧菌J14的藥敏性
藥物的敏感試驗(yàn)結(jié)果表明，2個(gè)菌株對(duì)青霉素、氨芐西林、阿莫西林和桿菌肽不敏感。文蛤源哈維氏弧菌對(duì)氨芐西林和阿莫西林不敏感；珍珠龍膽石斑魚(yú)(Epinepheluslanceolatus♂×E.fuscoguttatus♀)源哈維氏弧菌X12XC30對(duì)呋喃唑酮、阿莫西林和紅霉素耐藥，X13SZ03對(duì)四環(huán)素、呋喃唑酮、利福平、復(fù)方新諾明和頭孢克肟等耐藥。有研究顯示，不同年份、不同來(lái)源、不同養(yǎng)殖環(huán)境分離得到的哈維氏弧菌對(duì)抗生素的耐藥存在差異，環(huán)境、宿主影響細(xì)菌的耐藥性，同時(shí)抗生素的過(guò)度使用導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生更廣的耐藥性。本試驗(yàn)中的2株哈維氏弧菌對(duì)26種藥物敏感，其中氯霉素、呋喃唑酮、頭孢哌酮、頭孢曲松、頭孢噻吩、頭孢拉啶、諾氟沙星、氧氟沙星屬于水生食品動(dòng)物禁用藥，因此在泥蚶弧菌病的防治過(guò)程中應(yīng)合理合規(guī)用藥，通過(guò)改善泥蚶養(yǎng)殖環(huán)境水質(zhì)和底質(zhì)，以達(dá)到生態(tài)防治的目的。
結(jié)論
從浙江灘涂發(fā)病泥蚶中分離得到優(yōu)勢(shì)菌株J14，經(jīng)生理生化試驗(yàn)和16S rRNA基因序列分析，確定為哈維氏弧菌，該菌株具有較強(qiáng)的致病性，攜帶7種毒力基因，對(duì)慶大霉素、卡那霉素、復(fù)方新諾明等26種常用抗生素藥物敏感。
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