平湖紅曲黃酒釀造過(guò)程中真菌菌群動(dòng)態(tài)、紅曲霉生長(zhǎng)抑制因素（二）
2結(jié)果與分析
2.1平湖紅曲黃酒釀造過(guò)程中優(yōu)勢(shì)真菌菌群的變化
2.1.1優(yōu)勢(shì)真菌菌群結(jié)構(gòu)分析
以NS1/GCFung作為引物擴(kuò)增平湖紅曲黃酒各個(gè)釀造時(shí)間點(diǎn)所提真菌基因組的18S rDNA序列可變區(qū)，所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行變性梯度凝膠電泳（DGGE）分析。
在DGGE圖譜（圖2）中，平湖紅曲（泳道Q01）檢測(cè)到一條高亮條帶（Band 2），而平湖紅曲黃酒釀造過(guò)程中具有處于不同位置的2個(gè)高亮條帶（Band 1和Band 2），說(shuō)明Band 2對(duì)應(yīng)的菌株在平湖紅曲中屬于優(yōu)勢(shì)菌，并且Band 1對(duì)應(yīng)的菌株也存在于平湖紅曲中，并非優(yōu)勢(shì)菌，其提取效率低，因此Band 1在Q01泳道中條帶不明顯。
以純菌釀酒酵母NY02（Saccharomyces cere-visiae）及純菌紅曲霉B1（Monascus sp.）的DGGE條帶作為參照，發(fā)現(xiàn)Band 1和Band 2分別與兩純菌條帶處于同一位置，結(jié)合前期對(duì)平湖紅曲的真菌菌群結(jié)構(gòu)分析，可以確定平湖紅曲黃酒釀造過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)真菌主要是釀酒酵母和紅曲霉，說(shuō)明平湖紅曲在進(jìn)行傳統(tǒng)釀造過(guò)程中，與其它黃酒體系相比，真菌體系較為簡(jiǎn)單。
圖1乙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線
此外，觀察釀造過(guò)程中的菌群動(dòng)態(tài)變化，發(fā)酵前3 d，紅曲霉為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌，至發(fā)酵第4天后，酵母菌對(duì)應(yīng)的條帶逐漸變亮，紅曲霉對(duì)應(yīng)的條帶逐漸變暗，甚至幾乎消失，酵母逐漸取代紅曲霉作為釀酒的優(yōu)勢(shì)菌，可能與釀造過(guò)程中的環(huán)境變化有關(guān)，也可能與兩者生長(zhǎng)周期和生長(zhǎng)能力不同有關(guān)。
通過(guò)DGGE的定性分析可知，平湖紅曲黃酒釀造過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌為紅曲霉和釀酒酵母，欲探知兩種優(yōu)勢(shì)菌的菌群數(shù)量變化，還需結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)其進(jìn)行定量追蹤。
2.1.2優(yōu)勢(shì)真菌菌群數(shù)量變化
采用特異性引物Mp-F/Mp-R和SC1d/SC1r分別對(duì)平湖紅曲黃酒各個(gè)釀造時(shí)間點(diǎn)的紅曲霉和釀酒酵母菌量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示：兩種優(yōu)勢(shì)菌的變化趨勢(shì)與DGGE結(jié)果相符，釀酒酵母在發(fā)酵前期基本檢測(cè)不到，到第2天之后迅速增加，至發(fā)酵第5天達(dá)到5.51log10CFU/g，之后呈現(xiàn)緩慢增加的趨勢(shì)。紅曲霉的數(shù)量變化則與之相反，發(fā)酵第一天則迅速下降至4.62log10CFU/g，之后在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì)，在發(fā)酵第10天后下降明顯。
圖2平湖紅曲黃酒傳統(tǒng)釀造過(guò)程中真菌菌群結(jié)構(gòu)PCR-DGGE圖譜
由于第0天和發(fā)酵過(guò)程中的取樣方法的差異可能導(dǎo)致發(fā)酵第1天的菌量迅速下降。第0天是對(duì)紅曲進(jìn)行直接取樣處理，而整個(gè)發(fā)酵過(guò)程的取樣是對(duì)酒壇里的酒醅（曲米混合樣）進(jìn)行取樣處理，樣品狀態(tài)不一致，對(duì)菌量測(cè)定結(jié)果有一定差異。然而，在發(fā)酵過(guò)程中，操作一致的情況下，紅曲霉的菌量仍然緩慢下降，釀酒酵母則穩(wěn)步上升。針對(duì)紅曲霉菌量下降的可能原因有：（1）紅曲霉與釀酒酵母之間存在拮抗作用，釀酒酵母的生長(zhǎng)抑制了紅曲霉菌量的增加。然而，有部分學(xué)者研究表明，上述兩種菌可以互利共棲，產(chǎn)生協(xié)同作用。Shin等研究表明紅曲霉與釀酒酵母純菌株混合培養(yǎng)時(shí)，紅曲霉的生物量會(huì)增加至原來(lái)的兩倍左右。周學(xué)勤等研究發(fā)現(xiàn)酵母菌的添加并不會(huì)影響紅曲霉生長(zhǎng)曲線的基本模式，酵母菌及其細(xì)胞破碎液還可以提高紅曲霉的色素產(chǎn)量，因此二者相互抑制的可能性不大。（2）紅曲霉為好氧菌，由于傳統(tǒng)釀造過(guò)程中，從發(fā)酵第6天開始封罐壇，溶氧量的減少抑制了紅曲霉的生長(zhǎng)。（3）紅曲米對(duì)紅曲霉的物理性束縛阻礙了紅曲霉的生長(zhǎng)和釋放。紅曲本身是在蒸熟的大米上接種紅曲霉發(fā)酵制備而得，紅曲霉菌絲深入到曲米中，生長(zhǎng)空間有限，則在發(fā)酵過(guò)程不易被釋放出來(lái)。（4）紅曲浸泡液中可能存在某些生長(zhǎng)抑制因子，抑制了紅曲霉的生長(zhǎng)。（5）發(fā)酵過(guò)程中乙醇含量迅速增加，超過(guò)了紅曲霉的耐受能力，導(dǎo)致紅曲霉的生長(zhǎng)受到抑制。
基于此，試驗(yàn)將采用小體系的研究方法對(duì)紅曲霉菌量減少的原因進(jìn)行細(xì)化探究。在進(jìn)行小體系探究時(shí)，除了發(fā)酵條件應(yīng)與傳統(tǒng)釀造保持一致，還需要通過(guò)試驗(yàn)說(shuō)明紅曲霉能夠在小體系的糯米基質(zhì)上生長(zhǎng)，且小體系對(duì)于傳統(tǒng)發(fā)酵的模擬能夠重現(xiàn)紅曲霉的生長(zhǎng)變化規(guī)律，這樣小體系的構(gòu)建才有意義。
2.2.1模擬體系的構(gòu)建
采用小體系研究方法，利用三角瓶替代傳統(tǒng)酒壇進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵過(guò)程中紅曲、糯米及水的比例均與酒壇釀造一致，糖化時(shí)間、密封時(shí)間、發(fā)酵溫度等均嚴(yán)格模擬傳統(tǒng)發(fā)酵。
模擬傳統(tǒng)體系與傳統(tǒng)發(fā)酵體系相比，雖然在物質(zhì)傳遞、群體感應(yīng)、菌株拮抗、容器滲氧效果等方面可能有所不同，但結(jié)合圖3、圖4可以發(fā)現(xiàn)，模擬傳統(tǒng)的紅曲霉菌量緩慢下降，與酒壇釀造的變化趨勢(shì)頗為相似，說(shuō)明模擬傳統(tǒng)體系中紅曲霉的變化趨勢(shì)重現(xiàn)性較好，體系構(gòu)建較為合理，便于后續(xù)研究。
2.2紅曲霉的生長(zhǎng)抑制因素探究
另外，在純菌發(fā)酵體系中，紅曲霉的菌量逐步增加，說(shuō)明紅曲霉可以依附于糯米基質(zhì)上生長(zhǎng)，并且第6、7天的封壇發(fā)酵對(duì)紅曲霉的生長(zhǎng)抑制并不顯著，可見(jiàn)在封壇前期溶氧量的暫時(shí)減少并不是影響紅曲霉生長(zhǎng)的關(guān)鍵因子，發(fā)酵體系內(nèi)殘余的氧氣仍能促進(jìn)紅曲霉的生長(zhǎng)繁殖。
針對(duì)模擬傳統(tǒng)（混菌發(fā)酵）和純菌發(fā)酵體系中紅曲霉菌量變化的差異，以下將在小體系的基礎(chǔ)之上分別構(gòu)造體系以尋找影響紅曲霉生長(zhǎng)的關(guān)鍵因子。
2.2.2曲米的物理束縛對(duì)紅曲霉生長(zhǎng)的影響體系
1是在模擬傳統(tǒng)的基礎(chǔ)之上，將紅曲米進(jìn)行破碎，提取紅曲米中的菌株進(jìn)行混菌發(fā)酵。解除了曲米的物理束縛后，紅曲霉的菌量仍然逐漸減少（圖5），說(shuō)明曲米的物理狀態(tài)并不會(huì)對(duì)紅曲霉的生長(zhǎng)起到明顯的抑制作用。這可能由于紅曲米在制備過(guò)程中，將糯米進(jìn)行蒸煮后，有利于米粒中的游離水與淀粉發(fā)生反應(yīng)，使其糊化，而在糊化過(guò)程中，水分子進(jìn)入微晶結(jié)構(gòu)，打破了淀粉分子之間的聯(lián)系，使淀粉分子通過(guò)水合過(guò)程形成膠體體系，該體系的硬度明顯降低，減少了曲米中微生物生長(zhǎng)的機(jī)械阻礙。而曲米中的微生物在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中，會(huì)降解糊化體系中的淀粉，拓寬了微生物的生長(zhǎng)空間，干燥后使曲米形成多孔結(jié)構(gòu)，減少了曲米的物理束縛，因而對(duì)紅曲霉生長(zhǎng)的影響較不顯著。
2.2.3曲米浸泡液對(duì)紅曲霉生長(zhǎng)的影響
在紅曲米的制備及貯存過(guò)程中，曲米內(nèi)部和表面微生物分泌的代謝產(chǎn)物可能會(huì)對(duì)紅曲霉的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響，為探究此影響，構(gòu)建了體系2。該體系在純菌發(fā)酵的基礎(chǔ)上加入了無(wú)菌紅曲處理液，如圖6所示。結(jié)果表明，體系2的生長(zhǎng)曲線與圖4中的純菌發(fā)酵體系類似，紅曲霉的菌量穩(wěn)步增加，可見(jiàn)曲米浸泡液中的物質(zhì)在發(fā)酵過(guò)程中對(duì)紅曲霉的生長(zhǎng)抑制并不顯著，可能由于微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)通過(guò)代謝作用來(lái)改變生長(zhǎng)環(huán)境，從而利于它自身的生長(zhǎng)，而DEEG和qPCR的結(jié)果均顯示紅曲霉為紅曲米中的優(yōu)勢(shì)菌，曲米中積累的物質(zhì)難以對(duì)紅曲霉產(chǎn)生明顯的負(fù)面影響。
2.2.4酒精度對(duì)紅曲霉生長(zhǎng)的影響
構(gòu)建體系3，研究酒精度對(duì)紅曲霉生長(zhǎng)的影響。如圖7所示，空白組（KB）和4%酒精度樣品組①的糯米上都能布滿菌絲，而隨著乙醇濃度的增加，糯米培養(yǎng)基上的紅色菌絲逐漸減少，表明酒精度的增加對(duì)紅曲霉的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。
圖7體系3中不同酒精度下紅曲霉的生長(zhǎng)情況
試驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)傳統(tǒng)釀造過(guò)程中酒精度的變化與紅曲霉生長(zhǎng)的關(guān)系進(jìn)行細(xì)化研究。根據(jù)傳統(tǒng)酒壇釀造過(guò)程中酒精的變化情況（圖8），將各個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)體積分?jǐn)?shù)的乙醇加入帶有紅曲霉C1孢子液的糯米培養(yǎng)基中，單獨(dú)發(fā)酵3 d，結(jié)果如圖9所示。
由圖9可知，單獨(dú)發(fā)酵第1天紅曲霉的菌量就出現(xiàn)明顯差異，分別聚集在3個(gè)位置：（1）KB和傳統(tǒng)發(fā)酵第1～3天的酒精度對(duì)應(yīng)的紅曲霉菌量最多，且在后續(xù)發(fā)酵中基本持平，說(shuō)明酒精度低于4%時(shí)，對(duì)紅曲霉的生長(zhǎng)無(wú)影響；（2）傳統(tǒng)發(fā)酵第4～5天的酒精度（9%，12%）對(duì)應(yīng)的紅曲霉菌量居中，且在后續(xù)發(fā)酵中持續(xù)上升至與KB相當(dāng)，有研究表明紅曲霉可以耐受10%左右的乙醇，說(shuō)明此時(shí)的酒精度已臨近紅曲霉的耐受范圍，紅曲霉的生長(zhǎng)開始受到抑制；（3）傳統(tǒng)發(fā)酵第6～30天的酒精度，這些酒精度下對(duì)應(yīng)的紅曲霉菌量最少，且在后續(xù)發(fā)酵中，第6～10天的酒精度下紅曲霉菌量迅速增加，而發(fā)酵第20～30天的酒精度下紅曲霉的菌量則增加緩慢，抑制作用更明顯，該結(jié)果與DGGE圖譜的菌量變化相一致，即紅曲霉的條帶在發(fā)酵第20天明顯變淡。
3結(jié)論
試驗(yàn)結(jié)果表明傳統(tǒng)釀造體系的優(yōu)勢(shì)真菌為釀酒酵母和紅曲霉，其中紅曲霉在發(fā)酵前3 d占優(yōu)勢(shì)，之后其菌量逐漸下降，而釀酒酵母在發(fā)酵第3天后逐漸增加，并隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)逐步取代紅曲霉成為釀造中后期的優(yōu)勢(shì)菌。在模擬傳統(tǒng)和純菌發(fā)酵過(guò)程中，模擬傳統(tǒng)體系可以重現(xiàn)紅曲霉的生長(zhǎng)趨勢(shì)，而純菌發(fā)酵體系說(shuō)明了封壇前期溶氧量的暫時(shí)減少并不能顯著抑制紅曲霉的生長(zhǎng)。根據(jù)前期的對(duì)比研究，初步推測(cè)紅曲米的物理束縛、紅曲浸泡液中的物質(zhì)以及酒精度的增加可能會(huì)抑制紅曲霉生長(zhǎng)，針對(duì)這3個(gè)可能的影響因素構(gòu)造3種體系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，前兩者對(duì)于紅曲霉的生長(zhǎng)并不會(huì)起到顯著的抑制作用，而酒精度的增加是影響紅曲霉生長(zhǎng)的關(guān)鍵因子。試驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)傳統(tǒng)釀造過(guò)程中酒精度的變化與紅曲霉生長(zhǎng)的關(guān)系進(jìn)行深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵初期的酒精度（體積分?jǐn)?shù)0～4%）對(duì)紅曲霉無(wú)影響，而隨著酒精度的增加，紅曲霉的生長(zhǎng)逐漸受到抑制，至發(fā)酵后期的酒精度（體積分?jǐn)?shù)17%）對(duì)紅曲霉的抑制作用顯著，因而導(dǎo)致紅曲霉在DGGE上的條帶在發(fā)酵第20天明顯變淡。
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