CYP720B1基因突變型萊茵衣藻提高銅離子耐受性及吸附效率
重金屬元素在人們的日常生活中廣泛存在，由于其在農(nóng)業(yè)、工業(yè)與醫(yī)療業(yè)的普遍應(yīng)用使得它們?cè)谕寥酪约八w中均有所分布。在過去的幾年中，由于重工業(yè)的飛速發(fā)展，重金屬污染的土壤明顯增加，由于重金屬污染難以通過物理或化學(xué)方法有效降解，它們對(duì)地球的生態(tài)環(huán)境以及人類的身體健康造成嚴(yán)重的影響。而重金屬污染的水體一方面如果直接飲用可能會(huì)造成一些疾病甚至死亡，另一方面會(huì)通過各種食物鏈逐級(jí)遞增，富集到人體中，影響身體健康。因此，解決這樣的重金屬污染是重中之重。
銅是一類過度金屬，它的原子序數(shù)為29，原子量為63.5，也是世界上第三大的常用金屬。銅對(duì)于植物與動(dòng)物的生長(zhǎng)都具有不可替代的意義。在人體中，銅能夠促進(jìn)血紅蛋白以及血紅素的生成，維持正常的造血功能。除此以外，銅對(duì)于抗氧化作用以及維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的完整性也有著重要作用。然而，當(dāng)銅過量時(shí)，往往會(huì)引起較為嚴(yán)重的氧化應(yīng)激和組織損傷。一般情況下，與銅毒性相關(guān)的氧化應(yīng)激部分是其氧化還原反應(yīng)性的結(jié)果，例如游離銅或低分子量銅配合物催化超氧陰離子與過氧化氫之間產(chǎn)生羥基自由基，此外，銅也可以直接與半胱氨酸的游離硫醇結(jié)合，引起蛋白質(zhì)氧化損傷活性。當(dāng)人體攝入大量銅鹽時(shí)，往往會(huì)產(chǎn)生急性中毒的現(xiàn)象，患者會(huì)頭暈、嘔吐、腹痛、心跳加速、呼吸困難、溶血性貧血甚至肝腎衰竭死亡。當(dāng)攝入的銅在組織中過量時(shí)，可能會(huì)引起威爾遜氏病(Wilson's Disease)，如果能及時(shí)識(shí)別這種疾病，就可以采用低銅飲食或者螯合劑來緩解甚至治療，但是如果不多加干涉，往往會(huì)引起肝衰竭。此外，在大腦區(qū)域銅過量還會(huì)引起一些神經(jīng)退行性疾病，比如阿爾茲海默癥(Alzheimer's Disease)等，一些研究認(rèn)為金屬穩(wěn)態(tài)失調(diào)是引起阿爾茲海默癥的重要因素，銅離子與β淀粉樣蛋白的配合物催化活性氧的產(chǎn)生導(dǎo)致氧化損傷在阿爾茲海默癥中的病理發(fā)生中起著重要作用。
銅的最大濃度水平需要嚴(yán)格的調(diào)控，這就要求人們能夠使用合理的方法治理銅污染。一般來說，化學(xué)沉淀法是最為常用的策略，向銅污染水中加入沉淀劑，金屬陽離子與沉淀劑反應(yīng)從而形成不溶性物質(zhì)，與水完成分離，這種方法成本不高，能耗較低，操作也較為安全，但是處理后會(huì)產(chǎn)生大量淤泥，需要處置這種淤泥的成本較高，并且如果重金屬離子的濃度較低的情況下，使用化學(xué)沉淀法也難以見效。此外，離子交換技術(shù)也可以用于除去重金屬，通過離子交換樹脂與廢水中的金屬交換陽離子的能力來去除水體中的重金屬，這種方法沒有淤泥產(chǎn)生，去除重金屬的能力強(qiáng)，同時(shí)對(duì)去除的重金屬還有一定的選擇性，但是用于離子交換的樹脂需要再生，而再生液的處理成本十分高昂。除了這兩種方法外，混凝、膜過濾、電化學(xué)方法、吸附也都是常用的去除重金屬的技術(shù)。相比于這些傳統(tǒng)方法，生物修復(fù)因其支持環(huán)境可持續(xù)性和經(jīng)濟(jì)循環(huán)而成為一種更具有競(jìng)爭(zhēng)力的修復(fù)技術(shù)，微生物用于重金屬離子的吸附更為廣泛。微生物進(jìn)行金屬吸附一般包括兩個(gè)階段，第一個(gè)階段金屬離子與細(xì)胞表面無活性的組分結(jié)合，獨(dú)立于細(xì)胞代謝過程，而第二個(gè)階段是將金屬離子吸附進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，這個(gè)階段涉及細(xì)胞代謝過程。藻類細(xì)胞表面存在多種類型的金屬離子結(jié)合基團(tuán)，包括羥基、羧基、磷酰基、胺、咪唑等等，這些結(jié)合基團(tuán)使細(xì)胞表明的凈電荷為負(fù)，更有利于吸附重金屬離子。
萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是一種常見的單細(xì)胞微生物，已完成全基因組序列測(cè)序，培養(yǎng)周期短，并且對(duì)金屬脅迫有著較高的耐受性，目前廣泛用于金屬修復(fù)以及生態(tài)毒理學(xué)的研究中。萊茵衣藻有多種方式抵御重金屬脅迫，在其細(xì)胞表面有著細(xì)胞外聚合物(Extracellular Polymeric Substances，EPS)，細(xì)胞外聚合物由多糖、蛋白質(zhì)、核酸和腐殖質(zhì)組成，具有較強(qiáng)的結(jié)合金屬離子的能力，因此，金屬離子會(huì)與細(xì)胞壁以及細(xì)胞外聚合物結(jié)合，從而達(dá)成積累金屬的效應(yīng)。其次，萊茵衣藻細(xì)胞能夠通過膜轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)以及細(xì)胞內(nèi)絡(luò)合維持金屬穩(wěn)態(tài)，在萊茵衣藻細(xì)胞內(nèi)，有A組轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以及B組轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，A組轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)至衣藻細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，而B組轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將衣藻細(xì)胞質(zhì)中的金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞器中。萊茵衣藻也能夠通過植物螯合肽、硫氧還蛋白、谷胱甘肽等大分子物質(zhì)降低重金屬對(duì)細(xì)胞的毒害。
在基因突變技術(shù)日漸成熟的今天，許多研究者能夠構(gòu)建萊茵衣藻新的突變株在全基因組范圍內(nèi)進(jìn)行基因遺傳或功能鑒定，從而更好地研究突變基因在萊茵衣藻抗銅功能中所起的作用。
CYP720B1基因突變型萊茵衣藻對(duì)水溶液中銅離子耐受性及吸附效率鑒定方法，包括以下步驟：
(1)衣藻在Cu2+脅迫下的生長(zhǎng)狀態(tài)：
按照衣藻細(xì)胞的培養(yǎng)方法，從新鮮的TAP平板上挑取野生型、突變體，將細(xì)胞培養(yǎng)到S1代。在超凈工作臺(tái)內(nèi)取樣計(jì)數(shù)，然后用滅過菌的50mL離心管2500rpm，離心3min。將所有的細(xì)胞收集，用新鮮的TAP培養(yǎng)基重懸成濃度為1×108cell/mL的細(xì)胞懸液。將滅過菌的0.1M的Cu2+溶液分別添加0、200、400、600、800、1000μL到吹氣瓶中，在吹氣瓶中加入2mL濃度為1×108cell/mL的細(xì)胞懸液。然后用新鮮的TAP液體培養(yǎng)基將每個(gè)吹氣瓶中的液體補(bǔ)齊到200mL，獲得分別用0、100、200、300、400、500μM Cu2+TAP培養(yǎng)基處理的衣藻細(xì)胞。將處理好的細(xì)胞放置在光照培養(yǎng)箱內(nèi)光周期培養(yǎng)，然后按1、2、3、4天的時(shí)間點(diǎn)取樣計(jì)數(shù)，繪制生長(zhǎng)曲線，結(jié)果如圖1所示。從圖中可以看出，發(fā)現(xiàn)CYP720B1基因突變型萊茵衣藻具有高生長(zhǎng)速率，且具有較高的銅離子耐受性；野生型WT藻株生長(zhǎng)速率較慢，且容易受到銅離子的生長(zhǎng)抑制作用。
圖1野生型細(xì)胞株WT(a)與突變型細(xì)胞株CYP720B1(b)分別在Cu2+濃度為0-500μM的細(xì)胞生長(zhǎng)速率圖；
(2)Cu2+吸附效率測(cè)定：
按照衣藻細(xì)胞的培養(yǎng)方法，從新鮮的TAP平板上挑取野生型、突變體，將細(xì)胞培養(yǎng)到S1代。在超凈工作臺(tái)內(nèi)取樣計(jì)數(shù)，然后用滅過菌的50mL離心管2500rpm，離心3min。將所有的細(xì)胞收集，用純水清洗3遍，每次2500rpm，離心3min。最終用純水調(diào)成濃度為1×107cell/mL的細(xì)胞懸液。設(shè)定不同的吸附時(shí)間長(zhǎng)度(0.25、0.5、1、2、3、4h)。將對(duì)應(yīng)吸附時(shí)間點(diǎn)的樣本分別轉(zhuǎn)移至EP管內(nèi)，6000g室溫離心1min取上清，并做好標(biāo)記。將上述樣品加入新的24孔板中，對(duì)金屬液濃度超過75μM的樣品進(jìn)行稀釋，再按照國(guó)標(biāo)法加入對(duì)應(yīng)試劑等待顯色完成，然后用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD457的吸光值。將酶標(biāo)儀測(cè)定的吸光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，獲得不同上清樣品Cu2+濃度數(shù)據(jù)，將獲得數(shù)據(jù)導(dǎo)入GraphPad軟件，繪制統(tǒng)計(jì)圖，結(jié)果如圖2所示。從圖中可以看出，CYP720B1基因突變型萊茵衣藻在同等吸附時(shí)間和銅離子濃度條件下，比野生型WT藻株具有更高的吸附效率。
野生型細(xì)胞株WT與突變型細(xì)胞株CYP720B1分別在Cu2+濃度為0-500μM的細(xì)胞吸附效率圖
結(jié)論
總之，依托于萊茵衣藻的野生型細(xì)胞株，從萊茵衣藻野生型細(xì)胞株構(gòu)建的隨機(jī)突變體文庫中經(jīng)銅離子耐受性細(xì)胞篩選及基因鑒定，鑒定獲得了具有銅離子耐受功能調(diào)控的基因CYP720B1，該基因突變后導(dǎo)致衣藻細(xì)胞株的銅離子脅迫下的生物量增加顯著并且具有提高的銅離子吸附效率。依賴于后期研究，可期望解析該基因如何參與重金屬銅離子生物代謝等過程，并初步構(gòu)建基于該基因的基因工程化衣藻細(xì)胞用于重金屬銅離子型污水的生物修復(fù)及農(nóng)業(yè)水資源循環(huán)利用領(lǐng)域。
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